|
Реферат: Свечение сопровождающее биологические реакции (Биология)
ДОКЛАД
Энергично протекающие химические реакции сопровождаются, как правило,
выделением энергии в форме тепла; существуют, однако такие реакции, которые
сопровождаются излучением света. Свечение, сопровождающее химические
реакции, называется хемилюминесценцией (ХЛ).
Хемилюминесценция (ХЛ) - свечение, сопровождающее химические реакции.
Она наблюдается в том случае, если в реакции происходит выделение большого
количества энергии, например в реакции взаимодействия двух радикалов или в
реакциях с участием перекисей. В последнее время все больший интерес
привлекает собственное ("сверхслабое") свечение клеток и тканей животных и
человека, которое обусловлено реакциями свободных радикалов: радикалов
липидов и кислорода, а также окиси азота, - соединениями, играющими
огромную роль в жизни организма, а при определенных условиях - и развитии
ряда патологических состояний.
Молекулярный механизм хемилюминесценции
В настоящее время известно довольно много химических реакций,
сопровождающихся свечением. В большинстве случаев - это довольно сложные
процессы со многими промежуточными стадиями. Но есть несколько простых
случаев, в которых механизм превращения энергии химической реакции в свет
вполне понятен.
Один из них - это свечение, наблюдаемое при взаимодействии органических
радикалов, получаемых электрохимическим путем. В раствор люминесцирующего
органического вещества (в опытах брали полициклические углеводороды) в
органическом электролите (проводящем электричество) опускали пару
электродов, с помощью которых через раствор пропускали электрический ток.
Рис. 2. Хемилюминесценция при рекомбинации катион - и анион-радикалов
полициклических углеводородов. 1 - Между электродами, опущенными в раствор
органического электролита, прикладывают разность потенциалов. С катода
электроны захватываются молекулами и образуются анион-радикалы. На аноде
электроны отрываются от молекул и образуются катион-радикалы.2 - 5 - При
взаимодействии катион-радикала и анион-радикала в результате их
столкновения (2) электрон переходит с катион-радикала на анион-радикал (3).
Однако при этом есть вероятность того, что он окажется не на самом нижнем
электронном уровне, а на более высоком. Образуется возбужденная молекула
углеводорода (красный кружок на схеме 4). При переходе электрона на более
низкий уровень происходит высвечивание кванта света (5). Схема электронных
уровней в радикалах и молекулах продуктов реакции дана на рис. 3.
С катода (-) на молекулы люминесцирующего вещества (обозначим их как
НА) переходят электроны и образуются анион-радикалы (заряженные
отрицательно). На аноде (+) электроны отнимаются от молекул и образуются
катион-радикалы (заряженные положительно, см. рис. 2, вверху). Если теперь
раствор перемешать, катион-радикалы будут взаимодействовать с анион-
радикалами (рис. 2, внизу); при этом образуется две молекулы исходного
углеводорода, одна из которых может оказаться в электронно-возбужденном
состоянии и переходит в основное состояние с испусканием кванта света
(фотона).
На рис. 3 показаны верхние электронные энергетические уровни в
реагирующих радикалах и продуктах их взаимодействия. В молекулах на верхнем
заполненном электронном уровне электроны расположены попарно (рис. 3, 1). У
катион-радикала на верхнем уровне остается только один, неспаренный
электрон. У анион радикала появляется неспаренный электрон на следующем
(расположенном выше) энергетическом уровне (рис. 3, 2).
Рис. 3. Схема электронных энергетических уровней участников реакции
взаимодействия катион-радикала и анион-радикала одного и того же вещества.
1 - исходная молекула; 2 - анион-радикал; 3 - катион-радикал; 4 - перенос
электрона с анион-радикала на катион-радикал; 5 - перенос электрона в
электронно-возбужденной молекуле продукта реакции, который сопровождается
высвечиванием кванта света хемилюминесценции.
При взаимодействии радикалов (имеющих противоположный заряд и потому
притягивающихся друг к другу) произойти перенос электрона может произойти
таким образом, что два электрона окажутся на разных уровнях (рис. 3, 4).
Последнее означает, что один из ее внешних электронов оказывается не на
самом нижнем свободном электронном уровне, как у исходных молекул, а на
вышележащем электронном уровне. Такая молекула при переходе в основное
состояние испускает квант света (рис. 3, 5).
Мы видим, что весь процесс можно разделить на три стадии:
1. Восстановление одного из участников реакции (присоединение электрона)
и окисление второго (отрыв электрона). Это приводит к запасанию
химической энергии в системе, которая позднее выделится в виде фотона.
2. Перенос электрона (окислительно-восстановительная реакция) не на самый
нижний, а на один из более высоких энергетических уровней и
образование таким образом продукта реакции в электронно-возбужденном
состоянии.
3. Высвечивание фотона при переходе молекулы из электронно-возбужденного
в основное состояние (люминесценция). Обычно химические реакции,
сопровождающиеся свечением, протекают через целый ряд промежуточных
стадий, но основные этапы запасания и высвечивания энергии в общем
сходны .
Отечественный ученый А. Г. Гурвич был первым, кто указал на
существование собственного слабого свечения клеток животных и растений,
названного им "митогенетическими лучами". Согласно А. Г. Гурвичу,
митогенетические лучи - это очень слабое ультрафиолетовое излучение клеток,
которое индуцирует деление окружающих клеток. Хотя сам А. Г. Гурвич
использовал для обнаружения лучей только "биологический детектор", т. е.
разные делящиеся клетки, его последователи в России (С. Родионов и Г.
М. Франк, 1934г.) и за рубежом (R. Aubert, 1938 и другие) разработали
физический детектор излучения: газоразрядный счетчик фотонов с кварцевым
окном, прозрачным для УФ-лучей.
В настояще время слабое свечение удается изучать не только с растворах
или суспензиях клеток, но и на целых органах в составе организма например,
печени или легкого.
Таким способом было показано, что собственное свечение тканей могут быть
ответственны три типа реакций:
1) Реакции так называемых активных форм кислорода.
2) Реакции цепного (перекисного) окисления липидов.
3) Реакции с участием окиси азота.
В последнее время все больший интерес привлекает собственное
("сверхслабое") свечение клеток и тканей животных и человека, которое
обусловлено реакциями свободных радикалов: радикалов липидов и кислорода, а
также окиси азота, - соединениями, играющими огромную роль в жизни
организма, а при определенных условиях - и развитии ряда патологических
состояний.
Почему оно "сверхслабое", это свечение клеток и тканей?
Чем же объясняется низкая интенсивность хемилюминесценции,
сопровождающей реакции свободных радикалов?
Причин целых три. Во-первых, сама концентрация радикалов в
биологических системах очень мала из-за их высокой химической активности,
поэтому малы и скорости реакций, сопровождающихся свечением. Во-вторых, не
всякое химическое взаимодействие радикалов непременно приводит к
образованию электронно-возбужденных молекул продуктов реакции, как это
изображено на рис. 3 (4). Напротив, в подавляющем большинстве окислительно-
восстановительных взаимодействий между молекулами или радикалами электрон
переносится не на уровень возбужденного состояния, я на самый нижний
свободный уровень, и последующего высвечивания кванта не происходит. В
третьих, даже если и образовалась возбужденная молекула продукта,
вероятность того, что высветится квант, а не произойдет растраты энергии в
тепло, тоже обычно очень мала.
Две последние причины приводят к тому, что квантовый выход
хемилюминесценции в случае, скажем, реакции двух перекисных радикалов
составляет всего 10-8-10-10. Это происходит потому, что квантовый выход
образования возбужденных молекул продукта
равен всего 10-4-10-5, а квантовый выход люминесценции продукта
составляет для кетонов, образующихся при взаимодействии перекисных
радикалов, в свою очередь, тоже около 10-4- 10 - 5.
Вот и выходит, что общий квантовый выход хемилюминесценции составляет
всего-навсего 10-8-10-10.
Применение собственной (неактивированной) хемилюминесценции.
Почти сразу после того, как появились первые работы по собственной
хемилюминесценции клеток и тканей, были сделаны попытки использовать
этот показатель в целях клинической диагностики. По понятным причинам
первыми объектами были цельная кровь и плазма крови больных людей.
Поскольку собственное свечение было очень слабым и измерять его было
трудно, было сделано много попыток усилить это свечение: к плазме крови
добавляли красители, перекись водорода, ионы двухвалентного железа и т.д.
[4]. Природа химических реакций, обусловливающих свечение, была понятна
далеко не всегда, но авторов предложений это не слишком беспокоило: лишь бы
была разница между больными и здоровыми, а еще лучше между разными группами
больных. Скорее удивительно, что при ряде патологий разница была довольно
существенной. Пожалуй, наибольшее число публикаций в литературе посвящено
свечению плазмы крови, к которой для инициирования цепного окисления
липидов добавляли соли двухвалентного железа. Амплитуда сигнала
хемилюминесценции хорошо коррелировала с количеством продуктов перекисного
окисления липидов, определяемых химическим методом, и зависела от липидного
состава плазмы крови и концентрации в ней антиоксидантов, то есть веществ,
тормозящих процессы, идущие с участием
свободных радикалов. Во многих случаях данные таких анализов были признаны
ценными в качестве дополнительных при постановке врачом диагноза
заболевания, контроля за эффективностью лечения и прогноза течения болезни.
Все же измерение неактивированной хемилюминесценции в широкую клиническую
практику пока не вошло в отличие от хемилюминесценции в присутствии
активаторов.
В присутствии определенных соединений, обычно называемых в
отечественной литературе "активаторами", свечение клеток и тканей может
быть усилено на несколько порядков величины. Наибольшее распространение
получило измерение хемилюминесценции, связанной с выделением клетками
активных форм кислорода (к которым относятся супероксид, гидроксильный
радикал, перекись водорода и гипохлорит): хемилюминесценция наблюдается в
присутствии активаторов люминола и люцигенина. Активированная
хемилюминесценция довольно широко применяется в клиническом биохимическом
анализе.
Активированная хемилюминесценция
Собственная хемилюминесценция, сопровождающая биохимические реакции в
клетках и тканях, обладает, как правило, очень низкой интенсивностью и не
случайно получила название "сверхслабого свечения" . Это оказалось главным
и пока не преодоленным препятствием на пути к широкому использованию
собственной хемилюминесценции в аналитических целях.
Значительное распространение получило однако измерение хемилюминесценции
в присутствии определенных соединений, получивших в отечественной
литературе общее название "активаторов", а за рубежом - "усилителей"
(enhancer) хемилюминесценции. По механизму действия активаторы распадаются
на две четко различающиеся группы, которые можно соответственно назвать
химическими и физическими активаторами .
Химические активаторы ХЛ - это соединения, вступающие в реакции с
активными формами кислорода или органическими свободными радикалами, в ходе
которых образуются молекулы продуктов в возбужденном электронном состоянии.
Наблюдаемое при этом hemilum связано с переходом молекул в основное
состояние., что приводит к высвечиванию фотонов:
Активатор + радикалы > продукт* > продукт + фотон
Хорошо известными представителями таких активаторов могут служить
люминол (3-аминофталевый гидразид, см. Рис. 4) и люцигенин [Бис(N-
метилакридиний)] Физические активаторы не вступают в химические реакции и
не влияют на ход реакций, сопровождающихся hemilumм, но тем не менее
многократно усиливают интенсивность хемилюминесценции. В основе их действия
лежит физический процесс процесса переноса (миграции) энергии с молекулы
продукта хемилюминесцентной реакции на активатор:
Радикалы > продукт* > продукт + фотон 1 (неактивированная ХЛ)
Продукт* + активатор > продукт + активатор* > фотон 2 (активированная ХЛ)
Хемилюминесцентный иммунный анализ
По идеологии хемилюминесцентный иммунный анализ не отличается от
радиоиммунного, с той только разницей, что вместо радиоактивно-меченных
субстратов или антител используются субстраты и антитела,"меченные"
соединением, которое вступает в реакции, сопровождающиеся
хемилюминесценцией, в присутствии перекиси водорода и катализатора (обычно
это фермент пероксидаза).
Хемилюминесцентной меткой (ХЛ-меткой) чаще всего служат
низкомолекулярные соединения, по химической структуре близкие люминолу и
люцигенину, такие как изолюминол, сукцинилированный люминол, эфиры
акридиния и другие. Присоединение хемилюминесцентной метки производится
либо к антигену, т. е. низкомолекулярному соединению либо к антителу на
этот антиген. В первом случае метод называется CIA (Chemiluminescent Immuno
Assay), во втором - ICMA (ImmunoChemiluminoMetric Assay). По русски это
соответствовало бы ХИА (Хемилюминесцентный Иммунный Анализ) и ИХМА (Иммуно-
ХемилюминоМетрический Анализ).
Оба метода направлены на определение биологически-важных
низкомолекулярных соединений (например, гормонов) в тех концентрациях (как
правило, очень низких), в которых они встречаются в биологических объектах.
При использовании метода CIA к раствору, содержащему интересующее нас
анализируемое соединение (обозначим его как A) добавляют определенное
количество того-же, но ХЛ-меченного соединения (обозначим его как A*) и
антитела (анти-A). Образуется смесь меченных и немеченных иммунных
комплексов (A-анти-A и A*-анти-A, соответственно):
A + A* + анти-A > A-анти-A + A*-анти-A.
Очень важно, что пропорция между меченным и немеченым иммунными
комплексами зависит от того, сколько меченного антигена мы добавили (A*) и
сколько немеченого было в исследуемой пробе (A), а именно: чем больше было
немеченого антигена, тем меньше доля меченных антител.
Теперь остается очистить смесь иммунных комплексов и определить
количество A*-анти-A по хемилюминесценции. Интенсивность ХЛ будет тем
меньше, чем больше было немеченых антигена A (т. е. анализируемого
вещества) в исследуемой пробе. Чтобы анализ был количественным,
предварительно строят калибровочную кривую, т. е. измеряют зависимость
интенсивности ХЛ в конечной пробе от концентрации стандартного раствора
изучаемого вещества A. Затем измеряют интенсивность ХЛ в растворе с
неизвестной концентрацией антигена (A), повторяя те же процедуры, и по
калибровочной кривой находят концентрацию A.
При использовании метода ICMA берут избыток ХЛ-меченного антитела (анти-
A*) и добавляют к нему раствор с изучаемым веществом (A). Образуется ХЛ-
меченный иммунный комплекс:
A + анти-A* > A-анти-A*
Остается отделить иммунные комплексы от других участников реакции и
измерить интенсивность ХЛ. В данном случае она будет тем выше, чем больше
было анализируемого вещества A в пробе. Для количественного анализа и здесь
предварительно строят калибровочную кривую.
В обоих методах одна из практических трудностей - это очистка иммунных
комплексов. Она решается также методами иммунохимии. Детали этой техники мы
здесь рассматривать не будем, но один из подходов заключается, например, в
использовании порошка сорбента (см. Рис. 6 В), к поверхности которого
"пришиты" (т. е. присоединены ковалентной химической связью) антитела к
анти-А (назовем их анти-анти-А). В присутствии растворенных комплексов (А-
анти-А и/или А*-анти-А) образуется тройной комплекс ("сандвич"): (анти-анти-
А)-(анти-А)-А и/или (анти-анти-А)-(анти-А)-А*. Адсорбент можно осадить и
затем определить в осадке (после дополнительных обработок) количество
меченного антигена.
Биолюминесценция
Биолюминесценция - (БЛ) - это hemilum живых организмов, видимое простым
глазом. Способностью к БЛ обладают организмы, принадлежащие к самым разным
систематическим группам: бактериям, грибам, моллюскам, насекомым. Механизм
реакций, сопровождающихся hemilumм, весьма различен у разных видов; однако
обычно включает в себя химическое превращение определенного
низкомолекулярного субстрата, называемого люциферином, катализируемое
ферментом, называемым люциферазой.
С развитием техники измерения очень слабых световых потоков стало
ясно, что свечение при химических реакциях (хемилюминесценция) - не такая
уж экзотика. Слабое свечение сопровождает по существу все химические
реакции, идущие с участием свободных радикалов. Собственное свечение
животных клеток и тканей обусловлено преимущественно реакциями цепного
окисления липидов и реакциями, сопровождающими взаимодействие окиси азота и
супероксидного радикала.
Известное с древних времен видимое простым глазом свечение некоторых
организмов, например светляка, которое называют биолюминесценцией, также
нашло широкое применение в клинических анализах и медико-биологических
научных исследованиях.
Биолюминесценция светляка
Всем известное hemilum светлячков происходит в результате биохимической
реакции окисления светлячкового люциферина кислородом воздуха в присутствии
аденозинтрифосфорной кислоты (ATP):
|E + LH2 + ATP > E-LH2-AMP + PP |
|E-LH2-AMP P*-E-AMP > E + P + AMP + фотон |
Здесь AMP - аденозинмонофосфат, PP - пирофосфат, E - люцифераза, LH2 -
люциферин, P* и P - продукт реакции (оксилюциферин) в возбужденном и
основном состояниях, соответственно.
В отсутствие АТФ биолюминесценция не наблюдается; на этом основан один
из самых чувствительных методов анализа АТФ в различных объектах. Для
определения содержания АТФ смотрят хемилюминесценцию в изучаемом растворе,
к которому добавляют смесь люциферина и люциферазы, выделенных из
светлячков либо полученных синтетически и методом генной инженерии.
Удается определять содержание АТФ в образце от 10-17 моля и выше.
Поскольку биосинтез АТФ — показатель нормальной жизнедеятельности
клеток, препарат люциферин — люцифераза светляка используют для обнаружения
бактериального заражения в какой-либо среде, оценки жизнеспособности
эритроцитов при консервировании крови, изучения действия на микроорганизмы
антибиотиков и т В последнее время используют препараты иммобилизованной
люциферазы (т. е. фермента, молекулы которого химически связаны с
полимерной пленкой), стабильность которой выше; такой препарат можно
использовать многократно.
Биолюминесценция светящихся бактерий
К числу светящихся относится немного видов бактерий. Хемилюминесцентная
реакция, непосредственно сопровождаемая hemilumм, катализируется ферментом
— бактериальной люциферазой и включает в себя процессы окисления
восстановленного флавинмононуклеотида ФМН-Н2 до ФМН и одновременно -
алифатического (С14) альдегида до миристиновой (С14) кислоты В последние
годы получают все большее распространение биохимические анализы, в которых
в качестве тест-объекта используют целые бактериальные клетки (в
суспензии), экстракты светящихся бактерий, изолированный фермент -
люциферазу.
Прежде всего, измерение биолюминесценции бактерий можно использовать для
определения низких концентраций кислорода. Дело в том, что в отсутствие
кислорода фотобактерии не обладают hemilumм, hemilum усиливается
пропорционально концентрации кислорода в среде в интервале концентраций О2
от 2•10-8 до 5•10-6 моль/л.
Можно использовать светящиеся бактерии и в качестве "лабораторного
животного", т. е. живых организмов, на которых изучают, к примеру, действие
различных токсических веществ. Светящиеся бактерии весьма чувствительны к
примесям токсических веществ в воде, и измерение биолюминесценции можно
использовать для оценки загрязнения воды токсическими соединениями, скажем
ионами тяжелых металлов.
С другой стороны, hemilum бактерий можно использовать для
предварительной оценки эффективности новых антибиотиков. Но наиболее
перспективно, несомненно, применение очищенных препаратов бактериальной
люциферазы. Фермент, очищенный от примесей низкомолекулярных соединений,
обладает способностью к излучению света лишь в присутствии всех трех
субстратов: кислорода, ФМН-Н2 и длинноцепочечного альдегида (с длиной цепи
не менее 8 углеродных атомов). Добавив к изолированной бактериальной
люциферазе ФМН-Н2, исследователь получает высокочувствительную систему для
определения алифатических альдегидов; к их числу принадлежат, в частности,
половые гормоны насекомых, феромоны, которые обнаруживаются в количестве 10-
14 моль, что позволяет изучать метаболизм этих веществ у одной особи.
Биолюминесценция медузы Aequorea
В последнее время для обнаружения малых количеств ионов кальция широко
используется хемилюминесценция белка, выделенного из медузы Aequorea. Этот
фотопротеин, называемый акворином, содержит в себе ковалентно связанный
люциферин, который в присутствии ионов Са2+ подвергается химическим
превращениям с образованием продукта в возбужденном электронном состоянии.
Вследствие малой инерционности и высокой чувствительности биолюминесцентный
метод весьма эффективен при изучении высвобождения и связывания Са2+ в
биологических системах, например, во время мышечного сокращения. При этом
экворин добавляют прямо к изучаемому объекту и по интенсивности
биолюминесценции следят за динамикой изменения содержания свободного
кальция.
Заключение
Подобно многим другим разделам науки, хемилюминесценция и
биолюминесценция вначале были объектом исследования, а потом стали методом
исследования других объектов. На сегодняшний день химические и физические
явления, лежащие в основе чудесного превращения энергии биохимических
реакций в световое излучение, в основном расшифрованы.
Началось более или менее широкое использование хеми- и
биолюминесценции в биохимических лабораторных и клинических исследованиях.
Создаются серийные приборы - хемилюминометры и биолюминометры, выпускаются
наборы реактивов для анализа определенных антигенов, антител и ферментов в
крови больных и в других биологических жидкостях. Ведется поиск новых
соединений, обладающих способностью вступать в химические реакции,
сопровождающиеся hemilumм, с химически-активными продуктами
жизнедеятельности живых клеток, такими как свободные радикалы и пероксиды
(химические активаторы ХЛ), равно как и веществ, усиливающих квантовый
выход хемилюминесценции (физические активаторы ХЛ).
Одновременно с этим расширяется применение в аналитических целей
методов биолюминесценции. Прогресс органической химии, молекулярной
биологии и биотехнологии избавил нас от необходимости путешествовать на юг,
чтобы ловить по ночам светляков, или охотиться в океане за медузами, чтобы
выделить из живых существ фермент люциферазу и субстрат биолюминесцентных
реакций - люциферин: люциферины научились синтезировать, а многие
люциферазы можно получить сейчас методами генной инженерии. Короче говоря,
применение методов хеми- и биолюминесценции безусловно поможет пролить свет
на многие загадки, еще не решенные учеными.
Реферат на тему: Секвенирование (Генная инженерия)
ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение …………………………………………………………………………………………3
1. Определение нуклеотидной последовательности модифицированным методом
Максама и Гилберта ……………………………………………………………………………………….4
2. Секвенирование ДНК методом полимеразного копирования ( метод Сэнгера)
…………8
3. Филогенетический анализ геномов вирусов ………………………………………………15
4. Компьютерный анализ генетических текстов ……………………………………………..18
Заключение ……………………………………………………………………………………..22
Список литературы …………………………………………………………………………….23
ВВЕДЕНИЕ.
Разработка методов клонирования и определения последовательности
оснований (секвенирования) нуклеиновых кислот положила начало новому этапу
развития молекулярной биологии. Знание первичной структуры участков
генома, выполняющих определенные функции, дало возможность эффективно
применить для их исследования целый арсенал новых методов генной инженерии.
Эти методы (направленный мутагенез, рекомбинация in vitro и др.)
позволяют модифицировать участки нуклеотидных последовательностей и
исследовать их функции на молекулярном уровне. С их помощью комбинируются
участки генетического материала и создаются геномы с совершенно новыми
функциями.
Секвенирование нуклеиновых кислот в настоящее время стало рутинным
методом молекулярной биологии. Несомненно, в ближайшем будущем появятся еще
более совершенные автоматические секвенаторы, что приведет к резкому
увеличению числа расшифрованных последовательностей.
Благодаря знанию генетического кода появилась возможность определять
участки нуклеотидных последовательностей, кодирующих потенциальные белки.
Этот источник и сегодня дает нам основную информацию о функциональном
строении нуклеотидной последовательности.
1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ МОДИФИЦИРОВАННЫМ МЕТОДОМ
МАКСАМА И ГИЛБЕРТА.
Быстрый прогресс, наблюдавшийся в последние годы в различных областях
молекулярной биологии, во многом обусловлен появлением эффективного метода
определения первичной структуры ДНК. Этот метод, предложенный в 1977 г.
Максамом и Гилбертом, основан на селективной химической модификации
различных типов гетероциклических оснований в составе ДНК с последующим
расщеплением межнуклеотидных связей в модифицированных звеньях. Реакции
селективной модификации по каждому типу гетероциклических оснований
проводятся таким образом, чтобы в каждой молекуле ДНК в среднем
модифицировалось только одно звено данного типа. Поскольку все звенья
данного типа в составе молекулы эквивалентны и реагируют с модифицирующим
агентом с одинаковыми скоростями, то в сумме каждое звено этого типа
окажется частично модифицированным. Дальнейшая обработка ДНК вторичным
амином или щелочью приводит к отщеплению модифицированных гетероциклических
оснований от цепи ДНК и разрыву полинуклеотидной цепи в местах отщепления
гетероциклов (рис. 1).
Модификации подвергают ДНК, 32Р-меченные по 5'-концевому нуклеотидному
звену. Радиоактивная метка вводится фосфорилированием с помощью [pic]-32Р-
АТР и Т4-полинуклеотидкиназы. Таким образом, в результате химической
деградации получается набор фрагментов ДНК различной длины. Длины этих
фрагментов соответствуют положению мономерных звеньев того типа, который
подвергался модификации. Концевая радиоактивная метка служит точкой отсчета
при определении длины продуктов химической деградации ДНК (рис. 2)
Набор полученных фрагментов фракционируется электрофорезом в ПААГ,
который позволяет разделять олиго (поли) нуклеотиды, отличающиеся по длине
всего на одно мономерное звено. Последовательность нуклеотидов в ДНК
читается непосредственно с радиоавтографа геля.
Метод Максама и Гилберта, разработанный для анализа первичной
структуры достаточно длинных ДНК, применим и для коротких (8 – 16 звенных)
оли-годезоксирибонуклеотидов. Однако в этом случае реакции химической
модификации проводят в более жестких условиях (увеличивая время и
температуру реакции) с целью повышения степени модификации.
[pic]
Рисунок 1.1 Отщепление модифицированных звеньев от цепи ДНК после обработки
вторичным амином или щелочью.
[pic]
Рисунок 2 Химическая деградация ДНК.
Набор реакций, применяемых для расщепления ДНК по мономерным звеньям
определенного типа достаточно велик и постоянно пополняется: по остаткам
гуанина – обработка диметилсульфатом (рис. 3); по остаткам аденина и
гуанина – апуринизация 50%-ной муравьиной кислотой (по Бартону); по
остаткам аденина и цитозина – расщепление гетероциклических оснований под
действием 1,2 н. гидроксида натрия и по остаткам тимидина и цитозина –
обработка гидразином (рис. 4).
В настоящее время широко используются два основных варианта
секвенирования по Максаму — Гилберту. В первом из них реакции химической
модификации ДНК проводят в растворе, а во втором ДНК предварительно
иммобилизуют на твердой фазе (например, ДЭАЭ-целлюлозе). Первый метод более
традиционен, его многочисленные модификации с успехом использовались для
секвенирования фрагментов ДНК различных размеров, в том числе
олигонуклеотидов. В то же время второй метод имеет ряд преимуществ. Он
менее трудоемок и занимает меньше времени, проще в освоении, позволяет
обойтись минимальным набором оборудования. В целом оба метода обеспечивают
получение вполне приемлемых результатов, а выбор одного из них определяется
конкретными условиями лаборатории.
[pic]
[pic]
Рисунок 3 Реакция селективного расщепления по остаткам гуанина
[pic]
Рисунок 4 Реакция селективного расщепления по остаткам тимидина и цитозина.
2. СЕКВЕНИРОВАНИЕ ДНК МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОГО КОПИРОВАНИЯ.
(МЕТОД СЭНГЕРА)
Ферментативный синтез олиго(поли)дезоксирибонуклеотидов с помощью ДНК-
полимераз, заключающийся в копировании матричного полинуклеотида нашел
блестящее применение в качестве одного из двух наиболее эффективных методов
установления первичной структуры ДНК. Метод состоит в получении блоков-
копий полидезоксирибонуклеотида, структура которого изучается. При этом
обязательным является выполнение двух условий. Во-первых, копирование
должно проводиться, начиная с определенного мономерного звена. Во-вторых,
синтез копий следует осуществлять четыре раза, каждый раз останавливая его
поочередно на каком-либо одном из четырех мономёрных звеньев (A, G, С или
Т), иначе говоря, стремятся получить полный набор "комплементационно
отраженных" копий исследуемого полинуклеотида, образование которых
прекратилось в каждом из мест расположения одного из четырех мономерных
звеньев нуклеиновой кислоты. Определение длины каждой копии позволяет
установить положение данного мономерного звена в цепи исследуемого
полинуклеотида. Длина копии определяется фракционированием в
полиакриламидном геле. Этот метод, таким образом, так же как и метод,
основанный на модификации оснований позволяет получать информацию о
положении определенного мономерного звена в цепи полинуклеотида прямо после
фракционирования.
Для получения копии исследуемого полинуклеотида в последнем выбирают
точку отсчета, что достигается введением в систему ферментативного синтеза
в качестве нуклеозидного компонента олигонуклеотида-затравки. Такой
олигонуклеотид во всех копиях, образующихся в результате достраивания его
ферментативным путем, остается постоянным 5'-концевым фрагментом, т. е.
является точкой отсчета. Копирование с помощью ДНК-полимеразы в присутствии
всех четырех дезоксирибонуклеозид-5'-пирофосфатов (один из них берется
[pic]32Р-меченным) проводят в течение ограниченного времени. Цель этого
этапа - проведение статистически ограниченного синтеза для получения всех
возможных копий, начиная с затравки, достроенной на одно, два и т. д.
звеньев, и включая полную копию изучаемого полинуклеотида. В идеале смесь
должна включать все возможные полинуклеотиды (рис. 5), синтез которых
статистически прекращается где-то в середине матричного полинуклеотида в
районе ATGCTG матричной последовательности. На практике различные
компоненты смеси присутствуют в разных количествах. Если такую смесь далее
подвергнуть электрофорезу в полиакриламидном геле в определенных условиях,
когда скорость движения пропорциональна длине цепи, на электрофореграмме
обнаруживается серия полос, представляющих различные олигонуклеотиды. Такое
фракционирование обычно не проводят, хотя оно может использоваться
для контроля на
[pic]
Рисунок 5 Использование ферментативного синтеза
олиго(поли)дезоксирибонуклеотидов для определения первичной структуры ДНК.
завершающем этапе анализа. Инкубационную смесь 32Р-меченных
олигонуклеотидов различной длины в виде комплексов с матричным
полинуклеотидом подвергают гель-фильтрации для удаления
дезоксирибонуклеозид-5'-трифосфатов и аликвоты реакционной смеси
реинкубируют с ДНК-полимеразой в различных условиях. В случае "минус-
системы" реинкубацию проводят в присутствии только трех
дезоксирибонуклеозид-5'-три-фосфатов. Например, в «- А-системе» отсутствует
dATP и каждая копия в смеси достраивается с помощью ДНК-полимеразы до
места, в котором следующим мономерным звеном должен быть остаток pdA (т.е.
Т в матричном полинуклеотиде). Образующуюся смесь фракционируют с помощью
электрофореза и обнаруживают (ауторадиографически) ограниченное количество
полос (их количество равно количеству Т в матричном полинуклеотиде).
Аналогично проводят копирование в отсутствие других субстратов: - dGTP, -
dCTP или - dTTP (- G-,- С- и - Т-системы соответственно). Все четыре
ионофореза проводят в полиакриламидном геле параллельно. Полученные
ауторадиограммы позволяют сразу написать нуклеотидную последовательность,
причем чтение цепи снизу вверх соответствует 5'[pic]3'-полярности цепи
копии. Например, положение самого короткого олигонуклеотида (в " - Т-
системе") указывает на то, что следующий за ним по длине олигонуклеотид
заканчивается на Т, т. е. что против полосы, расположенной выше (это полоса
в - А-системе), следует записать букву Т. Таким же образом записывают
далее в последовательности букву А (на основании положения следующего по
длине олигонуклеотида, который оказался в "- А-системе") и т. д.
Соответствующий участок цепи в матрице читается с учетом принципа
комплементарности и антипараллельности цепей в комплексе матрица -
затравка. Для проверки этих данных используют результаты анализа с помощью
"плюс-системы". В этом случае дополнительное копирование (после первого
этапа) проводят в присутствии ДНК-полимеразы, выделенной из бактериофага
Т4, которая в отсутствие субстратов (нуклеозид-5'-трифосфатов) проявляет
3'-экзонуклеазную активность (аналогичную действию ФДЭ змеиного яда), т. е.
отщепляет мононуклеотиды один за другим с 3'-конца. В то же время в
присутствии субстратов ее полимеразная активность во много раз превосходит
экзонуклеазную. Так, если в реакционной смеси присутствует хотя бы один
дезоксирибонуклеозид-5'-трифосфат (dATP в " +А-системе"), деградация каждой
копии, образовавшейся на первой стадии анализа, будет проходить вплоть до
места положения А (Т в матрице). В этом случае pdA включается много
быстрее, чем удаляется, и, таким образом, накапливаются фрагменты,
содержащие на 3'-конце цепи А. Аналогично проводят копирование в
присутствии только dGTP, dCTP или dTTP. Смеси параллельно подвергают
электрофорезу, как и в предыдущем случае, и получают ауторадиограммы, из
которых сразу считывается последовательность 5'[pic]3'-направление,
считывается также снизу вверх). Из сравнения фореграмм "плюс-" и "минус-
систем" делается однозначный вывод о нуклеотидной последовательности в
копиях и, следовательно, в матричном полинуклеотиде.
В настоящее время выделение фрагментов ДНК, создание рекомбинантных
генов, а так же прямое секвенирование ДНК и кДНК становятся общедоступными
методами благодаря широкому внедрению ПЦР (полимеразной цепной
реакции).Сущность ПЦР заключается в использовании двух олигонуклеотидов-
праймеров, способных специфически гибридизоваться с последовательностями
нуклеотидов на противоположных концах двух цепей участка ДНК, в качестве
затравки для одновременного синтеза комплементарных цепей с противоположных
концов матрицы с помощью термостабильной ДНК-полимеразы. В ходе
повторяющихся циклов (температурной денатурации ДНК, отжига и
энзиматической достройки праймеров) экспоненциально увеличивается
количество дискретного фрагмента, фланкированного последовательностями
нуклеотидов, соответсвующих первичной структуре праймеров.
Применимость метода Сэнгера зависит от возможности получения
одноцепочечных копий клонированных ДНК. Для этой цели можно использовать
векторы на основе бактериофага М13. Двухцепочечную чужеродную ДНК можно
клонировать в двухцепочечной репликативной форме (РФ) фаговой ДНК, при этом
после трансформации в белковую оболочку будет упаковываться только одна из
цепей ДНК. Во всех векторах типа М13тр используются сходные полилинкерные
последовательности, поэтому для инициации полимеразных реакций пригоден
один и тот же универсальный праймер. При амплификации смеси генов
(например, семейства генов) необходимо провести клонирование ПЦР-продуктов
в векторах типа М13, в результате каждый фаг будет содержать только одну
вставку. При прямом секвенировании смеси генов наблюдается несколько
одинаково расположенных полос в разных дорожках геля. При амплификации же
одного гена можно проводить прямое секвенирование, не прибегая к
промежуточному субклонированию.
Выбор оптимального праймера для ПЦР зависит от 5 '- и 3 '-концевых
последовательностей амплифицируемого фрагмента ДНК. Кроме того, для
встраивания ПЦР-продукта в полилинкерный сайт вектора М13 в 5'-конец
праймеров должны быть включены подходящие рестрикционные сайты. В этом
случае ПЦР-амплификация с последующей рестрикцией продукта позволит
провести его встраивание в ДНК М13, рестрицированную тем же ферментом. В
разные концы амплифицируемого фрагмента лучше включать сайты для разных
рестриктаз, поскольку это позволит избежать отжига векторной ДНК самой на
себя и обеспечит положение клонированной вставки в определенной ориентации
(так называемое направленное клонирование). При подборе праймеров
необходимо учитывать следующие факторы.
а. Следует убедиться в том, что амплифицируемое семейство генов не
содержит консервативного внутреннего рестрикционного сайта, идентичного
сайту, включенному в праймер.
б. После включения рестрикционного сайта 5' - конец праймера нужно
удлинить, в противном случае рестриктаза не будет расщеплять праймер.
Необходимая для каждого фермента длина выступающего участка и время
рестрикции указаны в каталоге фирмы New England BioLabs.
Перед секвенированием двухцепочечную рекомбинантную ДНК М13 необходимо
перевести в одноцепочечную форму. Для этого ее вводят путем трансформации в
компетентные клетки E. сoli. Бляшки, содержащие одноцепочечные
рекомбинантные фаги, необходимо выколоть, нарастить в бактериальной
культуре и депротеинизировать.
Затем переносят культуру в микроцентрифужную пробирку на 1,5 мл и
центрифугируют в микроцентрифуге при 12 000 g в течение 5 минут. Переносят
1 мл супернатанта (содержащего чистый фаг) во вторую пробирку на 1,5 мл,
добавляют 200 мкл полиэтиленгликоля и инкубируют при комнатной температуре
как минимум 15 минут. Собирают фаг центрифугированием в течении 5 минут при
12 000 g и отбирают супернатант. Быстро повторяют центрифугирование и
полностью удаляют все следы супернатанта. Затем осаждают ДНК ацетатом
натрия, промывают ее 70%-ным этанолом и высушивают под вакуумом. Растворяют
ДНК в 30 мкл воды. Полученная ДНК представляет собой одноцепочечную матрицу
для секвенирования.
Ниже приведена конкретная методика секвенирования:
Материалы
• 5 х реакционный буфер: 200 мМ трис-HCl, рН 7,5, 100 мМ MgCl2, 250
мМ NaCl
• Буфер для разведения фермента: 10 мМ трис-HCl, рН 7,5, 5 мМ ДТТ,
0,5 мг/мл БСА
• 5 х смесь для мечения: по 7,5 мкМ dGTP, dCTP, dTTP
• Смесь для ddG-терминации: по 80 мкМ dGTP, dATP, dCTP, dTTP, 8 мкМ
ddGTP, 50 мМ NaCl
• Смесь для ddA-терминации: по 80 мкМ dGTP, dATP, dCTP, dTTP, 8 мкМ
ddATP, 50 мМ NaCl
• Смесь для ddC-терминации: по 80 мкМ dGTP, dATP, dCTP, dTTP, 8 мкМ
ddCTP, 50 мМ NaCl
• Смесь для ddT-терминации: по 80 мкМ dGTP, dATP, dCTP, dTTP, 8 мкМ
ddTTP, 50 мМ NaCl
• Стоп-раствор: 90% формамид, 20 мМ ЭДТА, 0,05% бромфеноловый синий,
0,05% ксилолцианол
• Универсальный праймер для секвенирования - 40 (0,5 пмоль/ мкл)
• [35S]dATP[pic]S (1 мКи/37 МБк в 100 мкл) (Amersham, UK; в состав
набора не входит)
• 0,1 М ДТТ
Методика
Все реактивы добавляют с помощью диспенсера на 2 мкл Hamilton (PB600),
соединенного с адаптером и шприцом 1710 с газовым затвором. Смесь для
мечения предварительно разбавляют в пять раз.
1. Для каждой секвенируемой матрицы смешивают в микроцен-трифужной
пробирке на 1,5 мл для получения праймерной смеси 6 мкл воды, 1 мкл
универсального праймера и 2 мкл реакционного буфера.
2. Размечают микроплашку Falcon 3911. В верхней ее части наносят
номера клонов, а слева, сверху вниз, — буквы TCGA.
3. На дно каждой ячейки наносят 2 мкл праймерной смеси, на боковые
стенки — по 2 мкл раствора секвенируемой матрицы и центрифугируют плашку.
Накрывают ее пленкой Saran® и крышкой и помещают в водяную баню с
температурой 70°С на 5 мин. Охлаждают плашку на столе (за это время
происходит отжиг праймера и ДНК М13).
4. Пока плашка охлаждается, готовят смесь для мечения. Для этого в
микроцентрифужную пробирку на 1,5 мл вносят 0,5 мкл 35S-dATP, 1 мкл 0,1 М
ДТТ, 2 мкл разведенной смеси для мечения и 3,5 мкл воды.
5. Размечают поликарбонатную микроплашку Techne 96® так же, как
первую плашку, и в ячейки в ряду "Т" вносят по 2 мкл смеси для ddT-
терминации. Аналогичным образом вносят смесь для терминации в ячейки
остальных рядов и помещают плашку в термостат для микроплашек с
температурой 42°С.
6. После охлаждения плашки (п. 3) в течение 30 мин добавляют к смеси
для мечения (для каждой матрицы) последовательно 1,77 мкл буфера для
разведения фермента и 0,22 мкл фермента Sequenase® II. (Это позволяет
держать фермент Sequenase® II вне холодильника минимальное время.)
7. По 2 мкл этой смеси наносят на боковую стенку ячеек, содержащих
праймерную смесь, и центрифугируют плашку для перемешивания компонентов.
Включают секундомер.
8. Через 2 мин начинают переносить раствор из ячеек первой плашки в
соответствующие ячейки предварительно нагретой и помещенной в термостат
поликарбонатной плашки. Для этого используют обычную микропипетку, быстро
меняя наконечники после каждой ячейки (помните, что использованные
наконечники радиоактивны).
9. После того как перенесен раствор из последней ячейки, включают
секундомер и в наконечник на шприце Hamilton набирают стоп-раствор.
10. Через 5 мин наносят по 5 мкл стоп-раствора на боковую стенку
каждой ячейки и центрифугируют плашку. После центрифугирования плашку,
закрытую крышкой, можно хранить в морозильнике до использования (при - 20°С
35S-продукты можно хранить в течение недели).
Амплифицированные последовательности нуклеотидов можно увидеть в УФ-
свете после фракционирования продуктов ПЦР с помощью гель-электрофореза
вприсутствии бромистого этидия. В большинстве случаев после ПЦР при наличии
1 - 10 нг ДНК-матрицы выявляется только одна полоса ДНК ожидаемой
электрофоретической подвижности. Чувствительность и специфичность детекции
продуктов амплификации значительной увеличиваются при использовании
различных вариантов ДНК—ДНК-гибридизации с олигонуклеотидами-зондами,
имеющими радиоактивную биотиновую, флюоресцентную или хемолюминесцентную
метку. Это сделало возможным проведение работ с минимально возможным
количеством материала, (например, с одной клеткой, одной копией гена) без
предварительной его очистки.
В качестве исходной матрицы для ПЦР может быть использована ДНК (или
кДНК, полученная с помощью предварительной обратной транскрипции РНК),
выделенная как из свежеполученных клеток и тканей, так и из замороженных,
высушенных или фиксированных препаратов, имеющих частично деградированные
нуклеиновые кислоты, т. е. объекты, ранее недоступные для анализа. Так, с
помощью методов ПЦР была амплифицирована, клонирована и секвенирована ДНК
египетской мумии, продемонстрирована возможность анализа специфических
участков ДНК при наличии одного волоса, клетки, сперматозоида в целях
идентификации личности и пола хозяина.
Серповидно-клеточная анемия, [pic]-талассемия, диабет, ревматоидный
артрит, мышечная дистрофия, фенилкетонурия, гемофилия, дефицит [pic]-
антитрипсина - вот далеко не полный список генетических заболеваний,
которые могут быть выявлены на ранних стадиях развития эмбриона с помощью
ПЦР Разработаны также подходы к раннему выявлению и прогнозированию
онкологических заболеваний.
3. ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗА ГЕНОМОВ ВИРУСОВ.
Филогенетический анализ молекулярных данных является одним из
подходов к теоретическому изучению структуры и функции генетических
макромолекул (РНК, ДНК, белков) и их эволюционного преобразования. Основная
цель филогенетического анализа - изучение эволюционного порядка дивергенции
последовательностей генов и белков или их частей, а также восстановление
списков эволюционных событий (замен нуклеотидов, делеций и вставок) в
предковых линиях этих макромолекул.
Основным инструментом филогенетического анализа является сравнение
близких по структуре или по функции генов или белков, и прежде всего,
сравнение их первичных последовательностей.
Важнейшим свойством функционально значимых структур макромолекул
является их эволюционный консерватизм. Чем меньше функциональная важность
отдельных участков генов, тем больше они имеют тенденцию к эволюционной
изменчивости. Так, например, псевдогены по-видимому полностью утратили
функциональную активность. Для них характерно быстрое накопление в ходе
эволюции различных замен, делеций и вставок, разрушающих исходную структуру
гена. С другой стороны, гистоны Н4, играющие важную роль в упаковке
хроматина, почти не изменялись на протяжении всей эволюции животных.
Консервативность генов позволяет выявить отдаленное родство между их
представителями, давно разошедшимися в ходе эволюции и выполняющими иногда
разные функции. Однако для филогенетического анализа необходимо и наличие
определенного уровня изменчивости генов. Мутации, делеции и вставки
являются своего рода метками, благодаря которым удается восстановить пути
эволюции современных форм макромолекул. Гены с разной величиной
консервативности пригодны для изучения разных эволюционных уровней. Сильно
консервативные гены и их продукты (гистоны, тРНК) нельзя , например,
использовать для исследования эволюции отрядов и более мелких таксонов, но
с успехом можно применять для изучения эволюции более крупных таксонов.
Сильно вариабельные гены, наоборот, дают хорошее разрешение лишь на поздних
эволюционных этапах.
В последнее время метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) с
последующим анализом нуклеотидной последовательности широко используется
для точной идентификации вирусов и определения их родства в отношении
других штаммов. Для сравнительной характеристики геномов различных штаммов
вирусов также проводят рестрикционный анализ ПЦР-продуктов. Обычно для
построения филогенетического дерева используются данные последовательностей
нуклеиновых кислот. Филогенетическое дерево очень ясно показывает родство
между вирусами, если анализируется большое количество изолятов. Для этих
целей существует много компьютерных программ. Наиболее популярные пакеты
программ- PHYLIP(PHYLogeny Inference Package), PAUP(Phylogentic Analysis
Using Parsimong),CLUSTAL и MEGA.
Для филогенетического анализа особенно интересны РНК-содержащие
вирусы, которые существуют как гетерогенные популяции. Их геном более
генетически пластичен, чем геном ДНК-содержащих вирусов.
Так, геном вируса бешенства, который относится к роду Lyssavirus
семейства Rhabdoviridae, представлен одноцепочечной негативной РНК длиной
около 12000 пар оснований (п.о) , кодирующей пять основных белков.
Белки подразделяются на три функциональные группы: оболочечные
(G ,M) нуклеокапсидный (N) и РНК-полимеразный комплекс, состоящий из L и NS
белков. Белки N,NS и L вместе с вирионной РНК образуют нуклеокапсид ,
который окружен мембраной, содержащей трансмембранный гликопротеин G ,
ответственный за антигенные свойства вируса. Существование псевдогена (
между G и L цистронами , является отличительной особенностью вируса
бешенства от вируса везикулярного стоматита.
N-ген лиссавирусов, как показало клонирование и секвенирование,
является наиболее консервативным по своей структуре из всех генов вируса
бешенства.
Mannen K.et al, в 1991 г. определили большую зависимость
различий в N-гене от географической локализации, чем от хозяйской
специфичности. В Онтарио вирус бешенства, который описан как единственный
«Арктический» тип, разделили на четыре основных типа. Эти типы
филогенетически разветвляются на две основные ветви , одна из которых
состовляет один тип, вторая три основных типа, что отражает историческое
передвижение вируса в регионе от середины к концу 50-х гг. Эпизоотия
передвигалась на юг Онтарио с севера и Квебека. Изменения в
последовательности N-гена , определенных для 4-х вирусных типов, могут
представлять генетический маркер для более существенных изменений в других
частях вирусного генома.
Kissi et al представили первое сравнение между генотипами и
молекулярными различиями N-гена внутри первого генотипа. Филогенетический
анализ гена нуклеопротеина 82-х лиссавирусов подтвердил существование шести
генотипов лиссавирусов, и также выделил изоляты бешенства первого генотипа
в отдельные генетические линии. Изоляты с меньшей чем 80% нуклеотидной и
92% аминокислотной гомологией относятся к различным генотипам. Два коротких
региона из 400 нуклеотидов, кодирующих аминоконец N-протеина, и 93
нуклеотида, кодирующих N-NS-регион, могут быть использованы для определения
географического распределения основных вирусных линий. Выявлено два
региона, имеющих наименьший уровень гомологии: участок длиной 199 пар
оснований (нуклеотиды от 1080-го до 1278-го) и более протяженный фрагмент,
расположенный между 99-м и 405-м нуклеотидами. Филогенетическое дерево
построили, используя пакет программ MEGA. С их помощью получили дерево с
ветвями, делящимися на 6 кластеров, которые соответствуют 6-ти генотипам.
Сравнение изолятов показало, что в генетическом плане наиболее близкими
оказались 4-й и 5-й генотипы, у которых уровень различий составил 79,8%
(нуклеотидный уровень) и 93,3% (аминокислотный уровень) [Duvenhage virus
(4) и EBL1(5)]. Внутри генотипа 1 наименьшее сходство среди изолятов из
Азии и Латинской Америки – 83,3%; и наибольшее сходство в изолятах из
Африки и Латинской Америки – 92,2%.
Филогенетический анализ изолятов 1-го генотипа вируса бешенства.
Kissi et al. идентифицировали 11 филогенетических линий, взятых
в соответствии с их географическим происхождением и видом хозяина: Африка
1а, Африка 1в, Африка 2, Африка 3, Азия, Арктика, Европа/Средний Восток,
Латинская Америка 1 и 2 и две группы вакцинных штаммов. Филогенетическое
дерево строилось на основании сравнения фрагмента или целого N-гена.
Этот анализ позволил более точно определить циркуляцию по зонам
и установить происхождение и распространение бешенства для некоторых линий,
которые, возможно, произошли независимо на этом континенте от различных
предшественников. Хотя циркуляция африканских вирусов 1а и 1в более отлично
от вирусов, распространенных в Европе и Среднем Востоке, однако была
выявлена генетическая связь между ними, что свидетельствует об общем
предке.
Выяснено, что накопление большинства нейтральных мутаций в
географически разделенных вирусных популяциях привело к значительным
расхождениям в нуклеотидной последовательности гена нуклеопротеина.
При исследовании гена нуклеопротеина 11-ти вирусов бешенства
японскими учеными было выявлено 9 отдельных кластеров по гомологии менее
90% региона N-гена. Тем самым они подтвердили данные филогенетического
анализа, полученные Kissi et al.
Таким образом, варианты вируса бешенства, сгруппированные в
соответствии с их географическим распределением, могут быть использованы
для исследования эволюционного развития вируса бешенства.
Принципы и методы ОТ-ПЦР.
Обратно-транскриптазная ПЦР состоит из двух этапов:
1- синтез комплементарной ДНК с помощью фермента обратной
транскриптазы и затравки
2- амплификация гена или его фрагментов при помощи фермента
термостабильной ДНК-полимеразы и коротких олигонуклеотидных 20-30-
членных затравок (праймеров), комплементарных 3'- концевым
последовательностям антипаралельных цепей ДНК гена. Повторяя стадии
денатурации, отжига праймеров и полимеризации (достройка праймеров)
30-35 раз за 2-3 часа получают миллионы копий специфического
участка генома вирусов и бактерий.
Анализ ПЦР-продуктов.
Аликвоты ПЦР-продуктов разрезают соответствующими ферментами и
разделяют в 1%-м агарозном геле. Учет результатов проводят по размеру ПЦР-
продуктов с помощью электрофореза в агарозном геле. На основании размеров и
расстояний пробегов маркерных ДНК вычисляют размеры исследуемых фрагментов
ДНК.
4. КОМПЬЮТЕРНЫЙ АНАЛИЗ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ТЕКСТОВ.
Выявление и анализ закодированных в последовательностях функциональных
сигналов требует применения современных методов информатики - качественных
баз данных с современными средствами управления, новейших методов
распознавания образов, статистических исследований, применения специальных
алгоритмов для преодоления возникающих вычислительных трудностей.
В настоящее время исследование функциональных свойств расшифрованных
последовательностей нуклеиновых кислот - это новый раздел молекулярной
биологии, граничащий с информатикой, с одной стороны, и молекулярной
биофизикой - с другой. Можно с уверенностью сказать, что в настоящее время
анализ последовательности биополимера позволяет извлечь лишь очень
небольшую долю закодированной в ней информации. В конечном счете точное
выявление функциональных особенностей в последовательностях нуклеиновых
кислот будет возможно только после детального исследования соответствующих
реакций, осуществляемых нуклеиновобелковыми комплексами.
Для оперативной работы с последовательностями создаются специальные
банки данных. В банке в доступном для пользователя виде хранится каждая
расшифрованная последовательность и ее паспорт, в котором указаны различные
сведения о ней. Это сведения об организме, из которого выделена
последовательность, о документе, где она описана, о расположении на ней
регуляторных участков и белках, которые она кодирует и т.д. В настоящее
время созданы три большие базы данных последовательностей нуклеиновых
кислот: "Genbank" (Лос-Аламос, США - более 30 млн. нуклеотидов), база
данных нуклеотидных последовательностей Европейской молекулярно-
биологической лаборатории (EMBL, Гейдельберг, ФРГ - более 30 млн.
нуклеотидов) и "Генэкспресс" (СССР, ВИНИТИ-ИМГ АН СССР - более 11 млн.
нуклеотидов). Известны также несколько белковых баз данных, наиболее
представительной из которой является MBRF-PIR (США). Эти базы данных
распространяются на различных носителях - магнитных лентах и дисках, на
оптических дисках.
Кроме построения филогенетических древ геномов вирусов компьютерный
анализ применяется при поиске гомологий, распознавании кодирующих областей,
функциональных сигналов, физическом (рестрикционном) картировании молекул
ДНК и для предсказания вторичных структур РНК.
Сейчас в мире создано большое количество программ ( обычно
организованных в пакеты ) , предназначенных для анализа последовательностей
нуклеиновых кислот и избавляющих исследователей от многих трудоёмких
рутинных операций , в том числе: подсчёт числа моно -, ди – и
тринуклеотидов, перевод нуклеотидной последовательности в аминокислотную и
т.д.
Все программы условно делятся на два класса: общего назначения и
специального. Первые осуществляют ряд_ наиболее распространенных операций
по сбору и анализу последовательностей и позволяют: вводить и редактировать
новые последовательности, считывать с помощью сканирующих устройств
информацию непосредственно с автографов или гелей', находить участки
узнавания эндонуклеаз рестрикции и представлять результаты в удобном
(табличном или графическом) виде, находить участки с элементами поворотной
и зеркальной симметрии (палиндромы), транслировать нуклеотидную
последовательность в белковую во всех трех рамках считывания, сравнивать
две последовательности методом точечных матриц гомологии, сравнивать новую
последовательность со всеми данными Ген Банка, находить участки,
обогащенные теми или иными нуклеотидами, вычислять гипотетическую
температуру плавления ДНК, осуществлять автоматическую сборку
секвенированных фрагментов в единую структуру - молекулу ДНК, транслировать
белковую последовательность в нуклеотидную с учетом неравномерности
использования кодонов-синонимов, определять молекулярную массу НК и белков,
предсказывать вторичную структуру белков, вычислять свободную энергию
образования шпилек и др.
Программы специального назначения создаются для решения более
специальных и часто более сложных задач и представляют интерес для более
узкого круга специалистов. Так, например, они могут выполнять ряд функций:
вычисление длины фрагментов ДНК на основании их электрофоретической
подвижности в гелях; выбор гибридизационных зондов; предсказание вторичной
структуры РНК; локализация нуклеотидов в гене, которые могут быть изменены
(без изменения аминокислотной последовательности) с целью введения сайта
узнавания эндонуклеазы рестрикции; нахождение участков с потенциально
возможной структурой Z-формы ДНК; выявление функционально значимых участков
в неизвестной вновь расшифрованной структуре на основании ранее выведенного
консенсуса (в результате сравнительного анализа ряда известных структур с
одинаковой функцией); локализацию участков, кодирующих белки, и т.д.
Для примера представлено меню пакета программ MICROGENIE, из которых
следует, какие функции общего или специального назначения может выбрать
исследователь при работе с нуклеотидными последовательностями.
Программа общего назначения "COMMON" обеспечивает ввод
последовательности в ЭВМ, а также проверку введенных данных в диалоговом
режиме. Они позволяют также редактировать нуклеотидные последовательности:
вводить замены и вставки, исключать нуклеотиды, вырезать, встраивать и
объединять нуклеотидные последовательности и таким образом моделировать
гибридные и мутантные молекулы ДНК. Ввод последовательностей в память
машины можно осуществлять вручную с клавиатуры, но в последнее время
созданы приборы для автоматического сканирования авторадиограмм и секвениру-
ющих гелей, полученных при использовании флуоресцентных меток , передачи
данных сразу в компьютер и последующего анализа последовательности с
помощью специальных программ. В недавно вышедшей в издательстве IRL
(Оксфорд) книге "Анализ сиквенса нуклеотидных кислот и белков" подробно
описываются как конструкция сканирующих устройств, так и программы для
чтения авторадиограмм. Созданы программы | |
