|
Реферат: Полноценные и неполноценные белки (Биология)
ПОЛНОЦЕННЫЕ И НЕПОЛНОЦЕННЫЕ БЕЛКИ
Существуют множество различных классификаций белков: по составу,
строению, функциональному назначению и т.д. Это обусловлено тем, что хотя
элементарный состав белков не велик и включает в себя лишь атомы C, H, O,
N, S, (иногда P) и белки построены из остатков лишь 20 аминокислот. Но с
другой стороны в состав их молекул может входить от несколько десятков до
сотен тысяч и даже миллионов аминокислотных остатков в различных вариациях,
и молекулы белка могут содержать всевозможные функциональные группы
(практически всю органическую химию). Но кроме того, с точки зрения пищевой
ценности белков, определяемой их аминокислотным составом и содержанием так
называемых незаменимых аминокислот, белки подразделяются на полноценные и
неполноценные.
Для поддержания жизнедеятельности и функционирования всех живых
организмов должен существовать постоянный обмен вещества и энергии. Главный
элемент, входящий в состав белков, который нужен всем живым организмам -
углерод. По источнику получения углерода организмы делятся на: автотрофные
- живущие за счет неорганического источника С (двуокиси углерода), к ним
относятся растения; гетеротрофные - использующие органические источники С,
к ним относятся млекопитающие. Углерод необходим организмам, т.к. является
составляющим элементом белков, из которых как из строительного материала
строятся клетки организмов - структурные и функциональные единицы живых
организмов.
Высшие растения способны синтезировать все необходимые им аминокислоты
и входящие белки. Для этого им нужен азот в виде аммиака или нитратов, сера
и фосфор в виде сульфатов и фосфатов, получаемые из почвенного раствора.
Источником углерода служит фосфороглицериновая кислота продукт фотосинтеза.
А из аминокислот в растениях синтезируются все необходимые для них белки.
Млекопитающие не могут синтезировать некоторые аминокислоты и поэтому
должны получать их в виде пищи. Таких незаменимых аминокислот восемь:
валин, лейцин, изолейцин, треонин, метионин, лизин, триптофан, фенилаланин.
Полноценными считаются белки включающие в состав эти восемь незаменимых
аминокислот. Причем продукты, содержащие эти белки не могут быть заменены
продуктами содержащими жиры и углеводы.
Белки - необходимая составная часть питания человека. Отсутствие или
недостаток их в пище вызывают серьезные заболевания. Основными источниками
белков для человека являются: мясо, яйца, рыба, фасоль, горох и бобы. В
отличие от углеводов и жиров в организме не происходит накапливания и
запасания белков. Если с пищей поступило больше белков, чем необходимо для
удовлетворения текущих потребностей, продукты гидролиза белков
(аминокислоты) подвергаются биохимическим изменениям и включаются реакцию
метаболизма (обмен веществ). Часть аминокислот, не использованных в
качестве структурных элементов и энергетического материала, лишаются группы
- NH2 и включаются в реакцию углеводородного обмена.
По этой причине питание должно включать все необходимые для
жизнедеятельности белки различного состава со структурой и свойствами,
соответствующими выполняемым ими функциям. Например:
. устойчивый, твердый белок кератина необходим для ногтей и волос,
. белки с нитевидными молекулами входят в состав мышц (они способны
укорачиваться и удлиняться),
. белки с мелкими и круглыми молекулами, легко растворимые, используются
для транспортировки вещества,
. белки высокоактивные, с легко изменяющейся структурой, выполняют функции
катализаторов и передачи сигналов в клетку из внешней среды.
Из этого видно насколько многообразны белки и их функции в организмах.
Поэтому так важен вопрос обеспечения организмов полноценными белками.
Белки являются важнейшим компонентом питания организмов по следующим
причинам:
1. С белками связаны основные проявления жизни - обмен веществ, сокращение
мышц, раздражимость нервов, способность к росту, способность к
размножению и даже мышлению.
2. Благодаря белковым веществам, гемоглобину и др., происходит перенос
кислорода.
3. Ферменты играют роль ускорителей биохимических реакций.
4. Гормоны - регулируют обменные процессы.
5. Нуклеопротеиды - в значительной степени определяют направление синтеза
белка в организме и являются носителями наследственных свойств.
6. Белки представляют основу структурных элементов клетки и тканей.
7. Связывая значительное количество воды, белки образуют плотные коллоидные
структуры, определяющие конфигурацию тела.
Несмотря на то, что белки составляют 1/4 часть человеческого тела и около
2/3 его плотного остатка, организм обладает лишь незначительными белковыми
резервами. Единственным источником образования белков в организме являются
аминокислоты белков пищи. Вот почему белки совершенно незаменимы в питании
человека. О полноценности снабжения организма белком судят по показателям
азотистого баланса.
Белки являются единственным источником усвояемого организмом азота.
Учитывая количество поступающего с пищей и выделяющегося из организма
азота, можно судить о благополучие или нарушении белкового обмена. В
организме взрослых здоровых людей, как правило, имеет место азотистое
равновесие, когда количество поступающего с пищей азота уравнивается с
количеством азота, выделяемого из организма. У детей азотистый баланс
характеризуется накоплением белков в теле (стимул роста), при этом
количество поступающего с пищей азота значительно превышает его выделение с
продуктами распада. В этих случаях врачи говорят о положительном азотистом
балансе. Положительный азотистый баланс в организме является признаком
здоровья. У людей получающих недостаточное количество белка с пищей или у
тяжелобольных, в организме которых белок усваивается плохо, наблюдается
потеря азота, то есть отрицательный азотистый баланс
Каковы же потребности человека в белке? Нередко за эту величину
предлагают принимать минимальную норму белка, необходимую для поддержания
азотистого равновесия в организме, ниже которой нормальная
жизнедеятельность человека невозможна. Для взрослого человека эта
минимальная норма составляет всего 40-50 г усвояемого белка в день. Нет
нужды доказывать, что эта величина намного ниже оптимальных потребностей
организма. При их определении необходимо исходить из интенсивности процесса
обновления белков в тканях организма, которая зависит как от индивидуальных
особенностей организма, пола, возраста, роста, веса и т.п., так и от
характера деятельности человека, обеспечения иммунных реакций, связанных с
защитой организма от инфекций и т.п. С увеличением интенсивности
физического труда возрастают и потребности организма в белке.
Нередко возникает вопрос: равноценны ли для человеческого организма
белки, содержащиеся в различных продуктах питания? Безусловно,
неравноценны. В настоящее время доказано, что пищевая ценность белков
различных видов зависит от их аминокислотного состава. Наибольшее значение
для определения полноты усвоения белков из 20 аминокислот имеют лишь 8,
которые являются незаменимыми в питании для взрослого человека (и на одну
больше для ребенка раннего возраста).
|Незаменимые |оптимальн|содерж| | | | | |
| |ые |ание | | | | | |
| | |аминок| | | | | |
| | |ислот,| | | | | |
| | |г на | | | | | |
| | |100 г | | | | | |
| | |продук| | | | | |
| | |та | | | | | |
|кислоты |соотношен|яйца |молоко|говядин|треск|мука.пш|картофе|
| |ия | | |а |а |. |ль |
|триптофан |1 |0,2 |0,05 |0,2 |0,16 |0,13 |0,02 |
|лейцин |4,0 - 7,0|1,1 |0,34 |1,4 |1,2 |0,8 |0,1 |
|изолейцин |4,9 - 4,0|0,8 |0,22 |0,9 |0,8 |0,48 |0,09 |
|валин |3,2 - 4,2|0,9 |0,24 |0,97 |0,9 |0,45 |0,1 |
|треонин |2,0 - 2,7|0,6 |0,16 |0,8 |0,7 |0,3 |0,08 |
|лизин |3,2 - 4,8|0,8 |0,3 |1,5 |1,5 |0,24 |0,1 |
|метионин |2,2 - 3,5|0,4 |0,09 |0,4 |0,5 |0,14 |0.03 |
|фенилаланин |2,0 - 4,0|0,7 |0,17 |0,7 |0,6 |0,58 |0,09 |
|гистидин(дет|1,5 |0,3 |0,09 |0,6 | |0,21 |0,1 |
|и | | | | | | | |
Незаменимые аминокислоты не синтезируются в организме и должны
обязательно поступать в организм с пищей. В соответствии с концепцией
сбалансированного питания можно назвать следующие величины, характеризующие
минимальные потребности в каждой из незаменимых аминокислот для организма
взрослого человека и их оптимальные соотношения, обеспечивающие полноту
использования белка. Иными словами, полное усвоение белка пищи может быть
достигнуто только при указанных соотношениях незаменимых аминокислот, т.е.
характеризующих их сбалансированность. Если какой-либо из названных
аминокислот в белках пищи будет меньше, то и другие аминокислоты не могут
быть полностью использованы организмом. Оценивая с этой точки зрения
огромное разнообразие белков, содержащихся в продуктах питания, мы должны
будем признать их выраженную неравноценность. Изучение аминокислотного
состава различных продуктов показало, что белки животного происхождения
больше соответствуют структуре человеческого тела. Более того,
аминокислотный состав белков яиц был принят за идеальный, т.к. их усвоение
организмом человека приближается к 100%. Очень высока степень усвоения и
других продуктов животного происхождения: молока (75-80%), мяса (70-75%),
рыбы (75-80%). В тоже время, многие растительные продукты, особенно
злаковые, содержат белки пониженной биологической ценности: в кукурузе,
например, обнаружен значительный дефицит лизина и триптофана, в пшенице -
лизина и треонина. В большинстве растительных материалов обнаруживается
недостаток серусодержащих аминокислот. Таким образом, в питании
значительной части населения земного шара отмечается определенный дефицит
аминокислот: лизина, трептофана и метионина, которые в известной мере
лимитируют усвоение пищи.
Знание особенностей аминокислотных составов различных продуктов
позволяет значительно более рационально использовать для удовлетворения
аминокислотных потребностей человеческого организма комбинации пищевых
продуктов по принципу взаимного дополнения лимитирующих их биологическую
ценность аминокислот. С этой точки зрения благоприятным является сочетание
растительных и молочных продуктов. Даже столь простое и широко используемое
сочетание ломтя пшеничного хлеба со стаканом молока делает их суммарную
аминокислотную формулу значительно более благоприятной, чем при раздельном
потреблении тех же продуктов. При этом следует иметь в виду, что введение в
злаковые продукты, например, обезжиренного молока в тесто, приводит не
только к увеличению общего содержания белка, но и к значительному эффекту,
получаемому от более полного усвоения белковых компонентов злаковых
продуктов. Выгодными с точки зрения соответствия оптимальной аминокислотной
формуле являются также разные мучные изделия с творогом (ватрушки,
вареники, сочники) и мучные блюда с мясом (пельмени, блины, пироги). В тоже
время пироги с рисом и другими крупами, повидлом, капустой, картофелем, с
точки зрения удовлетворения оптимальных потребностей организма в
аминокислотах являются менее оправданными.
Итак, мы установили, что человек нуждается в определенном количестве
белка. Он должен получать с пищей его достаточное количество, но
аминокислоты этих белков должны быть в определенных сбалансированных
отношениях. Таких пищевых продуктов, в которых не содержалось бы
необходимых для жизни аминокислот, почти нет, но их количество в разных
продуктах различно: в животных продуктах этих аминокислот много, в
картофеле и капусте - мало. Но и среду продуктов растительного
происхождения имеются источники достаточно ценных белков. Так, крупы
содержат от 6 до 16% белка, наиболее ценные белки содержатся в гречневой
крупе, овсянке, рисе и бобовых, особенно сое.
Все разнообразие пищевых продуктов в большинстве стран принято делить
на группы, отражающие как происхождение, так и особенности их химического
состава.
Первая группа - молочные продукты. Именно молоко почти полностью
обеспечивает потребности не только детского, но и взрослого организма. В
100 г молока содержится 3 г белка. Пол-литра молока в день - это более Ѕ
суточной потребности человека в животном белке. Белки молока содержат все
аминокислоты и в наилучшем соотношении, необходимом организму. В молочных
белках содержатся в значительных количествах метионин - аминокислота,
важная для обеспечения нормальной деятельности печени. Для людей,
работающих с вредными веществами, молочные белки имеют профилактическое
значение, т.к. улучшают деятельность печени и нервной системы. Очень
ценными продуктами питания являются различные виды сыров и творога. В
твороге содержится 17% белков, большое количество лецитина и несколько
меньшее количество незаменимой аминокислоты метионина. Различные сыры
содержат около 20% белка, сухое молоко - около 23%. Таким образом в молоке
и молочных продуктах весьма удачно сочетаются полноценные белки.
Вторая группа - мясо, рыба, яйца. Изучение аминокислотного состава
различных продуктов показало, что степень усвоения мясных продуктов очень
высока. Биологическая ценность белков рыбы не ниже, поскольку их
аминокислотные составы весьма близки. Установлено, что белки рыбы и многих
продуктов моря даже несколько легче перевариваются и усваиваются в
организме человека, чем белки мяса. Весьма ценным и питательным продуктом
являются яйца, в них содержатся лучшие по аминокислотному составу белки. До
настоящего времени сравнительно большой процент населения земного шара по
ряду мотивов, в том числе и религиозных, по-разному относится к мясу. В
ряде стран и у отдельных групп населения существуют многовековые запреты на
отдельные виды мяса. В Индии не едят говядины, а среди мусульман бытует
запрет на свинину. Славяне, как правило, не едят конину и с пренебрежением
относятся к мясу собак и лягушек. А в большинстве стран Азии и Европы
широко используется конское мясо. Мясо собак используется для питания в
Китае, а мясо лягушек считается деликатесом во Франции. Но биологическая
ценность мяса различных животных зависит не столько от особенностей
строения белков, сколько от содержания в нем экстрактивных веществ и других
соединений. В настоящее время нет никаких оснований утверждать, что
биологическая ценность белков конского мяса (или даже мяса лягушек) по
составу хуже мяса крупного рогатого скота и свиней. Мясо, несомненно, очень
полезный продукт благодаря высокому содержанию полноценного животного белка
- в различных сортах мяса и птицы содержится от 14 до 24% белка.
Взаимозаменяемость первой и второй группы. Продукты двух первых групп
являются наиболее важными поставщиками полноценного белка, с близкими по их
аминокислотному составу и хорошей усвояемости организмом. Продукты первой и
второй группы как источники белка в значительной степени могут заменять
друг друга. Это означает, что их следует включать в меню в эквивалентных по
содержанию белка количествах и в разнообразных сочетаниях с продуктами
растительного происхождения.
Третья группа - мука, хлебобулочные изделия, крупы, макаронные
изделия. Основное значение продуктов этой группы, содержащих большое
количество углеводов, - снабжение организма энергией. Как бы промежуточным
звеном между продуктами третьей и пятой группы является картофель.
Картофель употребляется населением многих стран в относительно больших
количествах. В 100 г картофеля содержится 2 г белка. В различных сортах
хлеба белка содержится от 4,7 до 7% белка. И при употреблении большого
количества хлеба и картофеля содержащиеся в них растительные белки
удовлетворяют общую потребность человека в белках примерно на 30 - 35%.
Четвертая группа - жиры. Дневная потребность взрослого человека в
жирах составляет 80 - 100 г, из них немного менее 1/3 должны составлять
растительные масла.
Пятая и шестая группы - овощи и фрукты. В овощах и фруктах содержится
всего 1,2 - 1,5% белков, но при достаточном потреблении овощей и фруктов и
эти белки имеют значение в питании человека. Белки картофеля и овощей,
особенно капусты, содержат жизненно необходимые аминокислоты в таких же
соотношениях, как белки животного происхождения.
Перечисленные шесть групп продуктов дополняют одна другую, обеспечивая
организм необходимыми материалами для построения и обновления структур
человеческого тела белками, различающимися многочисленными функциями,
структурой, составом. Подразделяющимися на полноценные и неполноценные,
отличающимися наличием или отсутствием восьми незаменимых аминокислот
(валин, лейцин, изолейцин, треонин, метионин, лизин, триптофан,
фенилаланин). Но признавая неравноценность продуктов с точки зрения
аминокислотного состава, и то, что белки животного происхождения более
соответствуют структуре человеческого тела, чем растительные; отметим, что
комбинация различных продуктов, по принципу взаимного дополнения
лимитирующих биологическую ценность их аминокислот, позволяет удовлетворить
потребность человека в белках и обеспечить их высокую усвояемость.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Грин Н., Стаут У., Тейлор Д. Биология. Т.1. - М.: Мир, 1990.- 368с.
2. Книга о вкусной и здоровой пище. Питание и здоровье /Гл. ред. акад. А.А.
Покровский. - М.: Пищевая промышленность, 1978.- 384с.
3. Павлов И.Ю., Вахненко Д.В., Москвичев Д.В. Биология: Пособие для вузов.
- Ростов-на-Дону: Феникс, 1996.- 576с.
4. Популярная медицинская энциклопедия /Гл. ред. А.Н. Бакулев. - М.:
Советская энциклопедия, 1966.- 1040с.
Реферат на тему: Получение моноклональных антител
Министерство образования Российской Федерации
Самарский Государственный Университет
Реферат на тему:
ПОЛУЧЕНИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ
Выполнила студентка 542 Б группы
биологического факультета СамГУ
Миронова Ирина
Самара
2001
Введение
Для многих исследований, связанных с изучением биологических структур
большую ценность представляют реагенты, способных специфически
взаимодействовать с данной структурой. Универсальным реагентом, обладающим
указанным свойством, считается молекула иммуноглобулина. Несмотря на то,
что иммуноглобулины, являясь антителами, взаимодействуют только с
антигеном, то есть с молекулой способной вызвать иммунный ответ, для
большинства структур удается подобрать условия, при которых они становятся
антигенами и индуцируют выработку комплиментарных антител (например, при
конъюгации с сильными иммуногенами). Именно этим объясняется большое
распространение иммунологических методов, связанных с использованием
антител, в различных областях биологии и медицины.
Серьезную проблему при применении антисывороток для идентификации и
количественного определения антигенов в различных областях исследований
представляет неспецифическое связывание и перекрестная реактивность
антител.
История создания метода
Многие исследователи пытались отыскать способы получения антител с
узкой специфичностью. Так, при определенных условиях иммунизации
бактериальными полисахаридами удается получить высокогомогенный аппарат
антител с узкой специфичностью. Кроме того, возможно слияние плазмацитомы
(опухоли, возникшей из антителообразующей клетки или ее предшественника) с
клетками селезенки иммунизированного животного, получив таким образом
гибридные клетки (гибридомы), унаследовавшие от опухолевых клеток
способность неограниченно размножаться, а от клеток селезенки –
синтезировать антитела предопределенной специфичности.
Предпосылками для возникновения метода получения гибридом,
синтезирующих моноклональные антитела, были разработки двух
методологических подходов:
1) получение миелом, адаптация их к условиям культивирования вне
организма;
2) метод соматической гибридизации клеток.
У мышей довольно легко получить миеломы (плазмацитомы). Эти опухоли
являются потомками одной клетки (то есть имеют моноклональное
происхождение) и секретируют уникальные иммуноглобулины, некоторые из
которых могут взаимодействовать с известными антигенами. Опухоли индуцируют
у животных путем внутрибрюшинного введения минеральных масел или инертного
твердого пластика. Для возникновения миелом большое значение имеет
генетический статус животного, и только у двух линий инбредных мышей
экспериментаторам удалось получить такие опухоли.
Миеломные клетки мыши оказались чрезвычайно удобными для изучения биохимии
продукции иммуноглобулинов и дали очень многое для понимания структуры,
механизмов секреции и их функции. Однако, миеломная система как источник
антител к большинству антигенов не оправдала надежды исследователей – не
удавалось иммунизировать животных, а затем получить мышиные миеломы,
продуцирующие антитела к иммунизирующие антигену. Из тысяч миеломных
опухолей, индуцированных у мышей, лишь единичные вырабатывали
иммуноглобулины, которые реагировали с известными антигенами, что было
обнаружено путем грубого скринирования с множеством потенциальных
антигенов. Таким образом, миеломные белки оказывались с неизвестной
антигенной специфичностью.
Другой предпосылкой возникновения метода получения гибридом явилась техника
гибридизации соматических клеток, разработка которых широко проводилась
после открытия феномена спонтанной гибридизации. При слиянии плазматических
мембран клеток образуются клетки с двумя или большим числом ядер –
гетерокарионы. После первого деления ядра сливаются и образуется одно ядро
с набором хромосом от всех слившихся партнеров – образуется гибридная
клетка. Низкую частоту образования гибридов можно было увеличить,
использовав ряд агентов, вызывающих слияние: вирус Сендай, лизолецитин,
полиэтиленгликоль.
Даже при использовании агентов, повышающих слияние, частота образующихся
гибридов крайне низка. Для их выделения необходимы селективные среды,
позволяющие расти преимущественно образовавшимся гибридам. В настоящее
время разработано несколько принципов селекции гибридных клеток. Одним из
наиболее распространенных является метод, основанный на применении системы,
содержащей гипоксантин, амидоптерин и тимидин (система ГАТ).
Селекция гибридных клеток основана на том, что в ГАТ среде родительские
миеломные клетки погибают, а нормальные клетки селезенки не обладают
способностью расти при данных условиях культивирования, так что выживают и
размножаются только гибридные клетки, унаследовавшие от родительских клеток
способность размножаться и синтезировать специфические иммуноглобулины.
Подготовительные этапы перед проведением слияния
Полностью процедура получения моноклональных антител включает в себя
следующие этапы:
иммунизация животных;
подготовка клеток к слиянию;
слияние;
отбор индуцирующих специфические антитела клонов;
клонирование и реклонирование;
массовая наработка гибридомных клеток;
получение культуральной жидкости или асцита, содержащих антитела;
выделение антител.
Обычно вся процедура от момента начала иммунизации до выделения антител
занимает 3-4 месяца.
Организация работы и оборудование. Для работы по получению гибридом
желательно выделить отдельное помещение. Эксперимент можно проводить и в
части большой комнаты, максимально удаленной от входной двери. Это
помещение надо оснастить следующим оборудованием:
Ламинарный бокс с вертикальной или горизонтальной подачей стерильного
воздуха. Стерильность обеспечивается наличием фильтров, задерживающих
частицы крупнее 0,3 мкм.
Инкубатор, в котором автоматически поддерживается влажность, температура и
концентрация СО2.
Низкоскоростная центрифуга с подвесными стаканами, желательно с
охлаждением.
Обычный и инвертированный микроскопы с фазово-констрастным устройством.
Холодильник на +4 и на –200 С.
Водяная баня на +37 и +560 С.
Помимо этого в отдельном помещении желательно иметь морозильник на –700 С и
сосуд Дьюара с жидким азотом для хранения клеток. Для получения гибридом
нужно приобрести также специальную пластиковую посуду для культуры клеток:
96-луночные планшеты с плоским дном, 24-луночные планшеты, флаконы с
площадью роста 25, 75 см2 и др., пластиковую посуду для проведения
иммуноферментного и радиоиммунологического анализов, среды для
культивирования, необходимые реактивы, сыворотку плода коровы (СПК).
Приготовление отдельных компонентов сред для культивирования. Основными
средами, употребляемыми для получения гибридом, являются среда RPMI 1640 и
среда Игла в модификации Дульбекко. Применяются и другие среды, в
частности, среда Дульбекко в модификации Иксова. Среды выпускаются в виде
готовых растворов, 10-кратных концентратов и сухих порошков. Лучшие
результаты получаются при приготовлении сред в условиях лаборатории из
сухих порошков, однако при этом важное значение имеет качество воды. Для
приготовления сред необходима деионизированная и дважды перегнанная в
кварцевой посуде вода.
Выбор экспериментального животного. Обычно для иммунизации используют мышей
и крыс. Это связано с тем, что подходящие миеломные клетки мышей и крыс
широко распространены и, кроме этого, не представляет сложностей
выращивание полученных гибридом в организме этих животных.
Другие животных практически не используются.
При иммунизации животных иммунный ответ вырабатывается на все антигенные
детерминанты всех компонентов вводимого материала. Это значительно
осложняет отбор клонов, продуцирующих антитела к интересующей антигенной
детерминанте, так как их доля может быть крайне незначительной. Поэтому по
возможности для иммунизации применяют очищенные антигены, по крайней мере
на последних этапах иммунизации. Одним из основных достоинств гибридомной
техники и является как раз то обстоятельство, что специфические антитела
против данного антигена можно получить, взяв для иммунизации неочищенный
препарат антигена, и употребив впоследствии эти антитела для очистки
антигена.
Способы иммунизации. Назначение процесса иммунизации состоит в том, чтобы
увеличить долю клеток, продуцирующих антитела заданной специфичности, и
перевести эти клетки в функциональное состояние, при котором они способны
сливаться и образовывать антителообразующие гибридные клетки.
Экспериментально установлено, что для гибридизации необходимы выделять
селезеночные клетки животных через 3-4 суток после последнего введения
антигена, то есть тогда, когда в лимфоидных органах много активно
пролиферирующих клеток.
Конкретная схема иммунизации сильно зависит от природы антигена и его
иммуногенности. Антигены клеточной поверхности являются сильными
иммуногенами, тогда как большинство растворимых белков – слабые иммуногены.
В последнем случае необходимо применять различные адъюванты, усиливающие
иммунный ответ. Среди адъювантов наибольшее распространение получил полный
адъювант Фрейнда (ПАФ). Помимо этого, используют введение антигена,
преципитированного на квасцах, и введение вместе с антигеном убитых клеток
Bordetella Pertussis. Обычно антиген вводят неоднократно, что необходимо
для развития сильного иммунного ответа, хотя чрезмерная иммунизация может
иметь обратный эффект – отмечено, что иногда у клеток гипериммунизированных
животных снижается способность образовывать гибридомы. В некоторых случаях
бывает достаточно и одной иммунизации.
По ходу иммунизации необходимо определять титр антител к антигену (титр
антител – величина, обратная разведению сыворотки, при которой степень
иммунологической реакции снижается в два раза по сравнению с максимальной).
Обычно это делают перед последней иммунизацией. В опыт набирают животных с
высоким титром антител. Не следует ожидать хороших результатов
гибридизации, если при иммунизации животных нет образования антител или они
образуются в низком титре.
Для большинства растворимых антигенов можно использовать следующую схему
иммунизации.
Вводят 1-100 мкг антигена в ПАФ или в виде преципитата на квасцах
внутрибрюшинно. Если есть возможность, то одновременно вводят 2*109 убитых
клеток B. Pertussis.
Через 2-3 недели вводят антиген на физиологическом растворе внутрибрюшинно
или внутривенно. Эту процедуру можно повторять до появления высокого титра
антител.
Последнюю иммунизацию делают внутривенно, через 3 суток животные
забиваются, и готовится суспензия клеток для гибридизации.
При применении в качестве иммуногена различных клеток (опухолевые клетки,
чужеродные клетки крови, бактерии, паразиты и т.д.) делают несколько
инъекций без адъюванта внутрибрюшинно с интервалом в 2-3 недели по (1-
5)*107 клеток. Последнюю инъекцию делают внутривенно и через 3 дня выделяют
клетки селезенки для гибридизации.
В последнее время активно развиваются методы полной иммунизации вне
организма с целью получения гибридомы. Иммунизация in vitro имеет ряд
существенных преимуществ:
укорачивается период иммунизации до 4-5 суток;
требуется существенно меньшее количество антигена;
ко многим антигенам можно получить более выраженный иммунный ответ
(частично за счет снижения вклада толерантности и супрессии);
повышается процент отвечающих клеток;
легко проверять факторы, влияющие на эффективность иммунизации.
Современные методы иммунизации in vitro основаны на двух системах
культивирования лимфоцитов, разработанных в конце 1960-х годов. Метод
суспензионного культивирования был первым методом, в котором иммунизация
полностью проходила вне организма. Критическими факторами в данном методе
были низкая концентрация кислорода в атмосфере (7%), высокая плотность
клеток, легкое покачивание культуры, ежедневное добавление свежей среды и
выбор подходящей партии СПК и антигена (использовали эритроциты барана).
Другой основной системой иммунизации in vitro является метод Д. Марбрука.
Клетки культивируют в маленькой камере на диализной мембране, через которую
идет обмен средой из большого резервуара.
Одним из основных недостатков иммунизации in vitro является доля IgM-
образующих клонов. Это связано с тем, что при иммунизации in vivo клетки
берут во время вторичного иммунного ответа, при котором образуются в
основном антитела IgG класса, тогда как in vitro реакция идет по первичному
типу, для которого характерна продукция IgM антител. Эта проблема может
быть преодолена после отработки способов получения вторичного иммунного
ответа in vitro.
Слияние
Существуют два основных варианта добавления ПЭГ, используемых в настоящее
время. Первый метода заключается в следующем. В течение 1 мин добавляют 1
мл 50% раствора ПЭГ при 370 С с постоянным перемешиванием. Затем раствор
постепенно разбавляют до 10 мл в течение нескольких минут средой без
сыворотки, после чего клетки центрифугируют и ресуспендируют в среде
культивирования.
Во втором методе используют более длительную обработку клеток раствором
ПЭГ. К осадку клеток добавляется 30-35% ПЭГ при комнатной температуре.
Клетки центрифугируют 2 мин, затем их оставляют при комнатной температуре
еще на 5-7 мин. Затем их разводят в большом объеме среды с сывороткой,
обмывают и культивируют.
Клонирование гибридомных клеток
Клонирование осуществляется для выделения стабильных клонов гибридомных
клеток. Для недавно образованных гибридомных клеток характерна высокая
нестабильность, связанная с утратой хромосом. При культивировании могут
появляться клетки, потерявшие способность продуцировать антитела и они
могут перерастать антителообразующие гибридные клетки.
К основным методам клонирования клеток относятся клонирование методом
лимитирующих разведений, клонирование в полужидком агаре и клонирование с
помощью прибора – проточного цитофлуориметра.
Клонирование методом лимитирующих разведений. Если клетки посеяны в 96-
луночные планшеты очень редко, то доля лунок, в которой наблюдается рост
клеток, подчиняется распределению Пуассона:
[pic]
где f (0) – фракция лунок, в которых отсутствует рост; ( – среднее число
клеток на лунку.
При ( = 1 f (0) = 0,37. Для того, чтобы получить разумную вероятность
только одного клона в лунке, в более 37% лунок не должно наблюдаться роста
клеток. Поскольку эффективность клонирования редко бывает равной 100%,
клетки необходимо засевать при плотности 10, 3 и 0,5 клеток на лунку. В тех
планшетах, на которых наблюдается рост в половине лунок, содержатся
изолированные клоны.
При первом клонировании активной может оказаться только небольшая часть
клонов. Необходимо всегда производить повторное клонирование, при котором
доля положительных клонов будет возрастать.
Для клонирования надо применять клетки питающего слоя. Используются те же
виды клеток, что и для начального роста гибридом.
Клонирование в полужидком агар-агаре. Для клонирования гибридом можно
применять полужидкий агар. Обычно берется система, состоящая из двух слоев.
Нижний (твердый) слой содержит 0,5% агар-агара в среде культивирования. Ему
дают затвердеть. Затем добавляют второй слой – мягкий, содержащий 0,3% агар-
агара, в который включаются клонируемые клетки. При использовании клеток
питающего слоя их засевают в чашку Петри до заливки агар-агара, и среду
культивирования удаляют непосредственно перед добавлением нижнего слоя
агара.
Колонии становятся видимыми через 7-14 суток, их переносят на жидкую
культуру.
Клонирование с помощью проточного цитофлуориметра. Приготавливают
флуоресцентные микрошарики из латекса и покрывают их антигеном. Такие
шарики адсорбируются на антигенспецифических гибридомных клетках, что
позволяет выделять их на этом приборе.
После выделения тем или иным способом положительных клонов, клетки этих
клонов размножают в достаточном количестве и образцы их замораживаются.
Массовая наработка моноклональных антител
После отбора гибридомных клеток, синтезирующих интересующие исследователя
антитела, можно приступить к их массовому наращиванию с целью получения
больших количеств моноклональных антител. В начале культивирования
гибридомные клетки могут расти медленно и плохо переносить низкую плотность
посева. В связи с этим при пересеве клеток их надо разводить не более чем в
3-5 раз. Ускорению роста клеток может способствовать добавление клеток
питающего слоя. Гибридомные клетки необходимо поддерживать в
логарифмической фазе роста и избегать повышения концентрации клеток выше
0,5 млн/мл. Клетки можно культивировать как в стационарной культуре, так и
в роллерной, а также в различного рода культиваторах (ферментерах).
Для получения максимальной продукции моноклональных антител клеткам
позволяют расти до предельной плотности. В такой культуре через
определенное время наблюдается гибель гибридомных клеток. Надосадочная
жидкость собирается, а клеточный осадок отбрасывается, то есть не пытаются
культивировать дальше оставшиеся живые клетки.
Для получения больших количеств антител вводят гибридомные живые клетки в
организм животных и получают от них асцитную жидкость. Предварительно
животным вводят агенты, повышающие способность гибридом расти в брюшной
полости. В качестве такого агента чаще всего выступает пристан – 0,5 мл за
10-14 суток до введения клеток.
Очистка антител
Для многих целей не требуется очистка антител, и они используются в виде
культуральных жидкостей или асцитных жидкостей. Грубую иммуноглобулиновую
фракцию можно получить высаливанием белков сульфатом аммония с последующим
диализом. Если антитела необходимо выделить в чистом виде, то
предварительно определяют их класс и подкласс, так как способы очистки
различаются для антител разных классов. Это можно сделать с помощью метода
иммунодиффузии по Ухтерлони.
Выделение чистых антител лучше всего проводить на иммуносорбентах. При этом
методе, однако, есть опасность, что при фиксации изменяется антигенная
структура клеточной поверхности.
Если не удается выделить антитела прямым способом, то получают
иммуноглобулиновую фракцию с помощью различных методов аффинной и
ионообменной хроматографии на сефарозес пришитым ковалентно белком А.
Заключение
Одна из задач клеточной инженерии состоит в создании клеточных систем с
новыми свойствами на основе клеточных взаимодействий. В настоящее время
совершенствуются методы иммунизации вне организма и изучаются механизмы
активации В-лимфоцитов. Это особенно важно для получения моноклональных
антител человека.
Одним из условий дальнейших успехов на пути получения клеток и клеточных
систем с новыми свойствами является углубление знаний, касающихся
фундаментальных основ биологии: механизмов регуляции процесса клеточной
дифференциации, физиологии протопластов как объекта биологической
трансформации клеток, взаимоотношений клеточных органелл. Следовательно,
прогресс в развитии клеточной инженерии будет в значительной степени
определяться успехами в области клеточной биологии и клеточной физиологии.
| |
