|
Реферат: Методы измерения ионных токов (Биология)
МИНИСТЕРСТВО ОБЩЕГО И ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ
РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
НИЖЕГОРОДСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ. Н.И.ЛОБАЧЕВСКОГО
БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ
КАФЕДРА БИОФИЗИКИ
Реферат на тему
Методы измерения ионных токов
Выполнил студент
4 курса
гр.144-7
Савин А.В.
Нижний Новгород
1998
1. Метод фиксации потенциала
Для изучения потенциалзависимых мембранных каналов применяется метод
фиксации потенциала. В данном методе используют электронную систему с
обратной связью, которая обеспечивает автоматическое поддержание
мембранного потенциала. Разность потенциалов по разные стороны мембраны
фиксируют на определенном уровне, при этом мембранный потенциал можно
ступенчато изменят на строго определенную величину. Такой метод позволяет
измерить ионные токи, протекающие сквозь мембрану через каналы, которые
активируются при изменении потенциала. В соответствии с законом Ома, если
напряжение на мембране постоянно, изменения тока однозначно связанные с
изменениями проводимости. В свою очередь, мы можем фиксировать мембранный
потенциал на разном уровне и измерять возникающие при этом токи. Если же
использовать растворы с различенным ионным составом, и препараты,
избирательно блокирующие тот или иной канал, то можно будет изучать
поведение различных ионных каналов, через которые протекают измеряемые нами
токи. Технически фиксация потенциала осуществляется следующим образом. При
помощи усилителя-регулятора внутриклеточный потенциал сравнивают с
управляющим потенциалом (см. рис.1). Любое отклонение мембранного
потенциала от управляющего усиливается и на выходе усилителя возникает
управляющий ток. Этот ток течет через электроды, расположенные по разные
стороны мембраны в таком направлении, что мембранный потенциал вновь
становится равным управляющему. Такое автоматическое согласование
происходит за долю миллисекунды после того, как задается ступенчатый
управляющий потенциал.
Когда в ответ на такую ступенчатую деполяризацию открываются натриевые
(или какие-либо другие) каналы, соответствующие ионы входят в аксон по
электрохимическому градиенту и переносят с собой электрические заряды. Эти
входящие заряды стремятся сдвинуть мембранный потенциал в положительном
направлении, однако малейшее отклонение от управляющего потенциала
немедленно компенсируется в результате удаления из клеток избыточных
зарядов с помощью усилителя-регулятора. При этом записывается тот ток,
который подается усилителем для поддержания мембранного потенциала на
необходимом уровне, и этот ток в точности равен ионному току, протекающему
через мембрану.
Метод фиксации напряжения, или кламп метод, позволяет измерять ионный
поток при перемещении иона по контролируемому градиенту
электрохимического потенциала и получать информацию об электрической
проводимости мембраны и её пассивной проницаемости в отношении
интересующего нас иона. Этот метод используется для измерения вольт-
амперных характеристик растительных клеток, что позволяет получить
информацию о тонких механизмах функционирования различных систем
мембранного транспорта.
2. Метод пэтч-кламп
Метод пэтч-кламп (patch-clamp) позволяет осуществлять локальную
(точечную) фиксацию мембранного потенциала и измерять токи через одиночные
ионные каналы. На данный момент этот метод является мощным средством для
исследования биомембран. Метод позволяет:
1. проводить многие исследования в рамках классических
электрофизиологических подходов.
2. регистрировать токи и потенциалы от клеток очень малых размеров (3-10
мкм)
3. регистрировать токи одиночных каналов амплитудой порядка пикоампер
4. исследовать действие лекарственных препаратов при быстром подведении
их как к наружной, так и к внутренней стороне мембраны
Метод пэтч-кламп был введен в исследовательскую практику Неером и
Сакманом, когда в 1976 году ими была опубликована статья в журнале
“Nature”, которая называлась “Токи через одиночные каналы в мембране
волокна денервированной мышцы лягушки”. Это открыло путь для изучения на
молекулярном уровне электрических свойств мембран и регуляции различных
транспортных процессов.
Основой для создания метода послужило обнаружение факта, что при
определённых условиях клеточная мембрана формирует очень плотный контакт с
поверхностью кончика стеклянного микроэлектрода. При небольшом разрежении,
создаваемом внутри пипетки, между стеклом и мембранным фрагментом возникает
контакт, имеющий гигаомное сопротивление. В результате образуется
электрически изолированный участок мембраны, и шум регистрирующего сигнала
уменьшается на несколько порядков. Так как контакт мембраны со стеклом
очень прочен, то находящийся под кончиком электрода фрагмент надо либо
изолировать от клетки, либо разрушить, и таким образом проникнуть внутрь
клетки. Существует несколько вариантов метода пэтч-кламп (рис.2).
Наиболее близким к естественным условиям является вариант измерения
ионных токов на прикреплённой, но неповрежденной (cell-attached)
клетке, поскольку исследуемый участок г99зэмембраны не отделяется от клетки
и не нарушается его связь с цитоплазмой. Измерение на целой клетке при
разрушении мембраны в кончике микропипетки (whole-cell) позволяет заменять
ионный состав цитоплазмы и изучать на диализированных таким образом клетках
ионные токи в режиме фиксации напряжения.
Ионные токи через небольшие мембранные фрагменты измеряют с помощью
пипеток, у которых диаметр кончика соизмерим с размерами фрагментов.
Сопротивление пипеток, заполненных раствором 150 ммоль/л KCl и погруженных
в раствор такой же концентрации, приблизительно линейно зависит от площади
отверстия кончика и варьирует от 1 до 5 МОм. Площадь отверстия кончика
пипетки можно варьировать от 1 до 8 мкм2, изменяя степень нагрева спирали
на последнем этапе вытягивания. Эти размеры находятся на грани разрешения
светового микроскопа. Наружную поверхность покрывают гидрофобным материалом
– силгардовой резиной. Особенностью незастывшего силгарда является его
способность растекаться тонкой пленкой по поверхности стекла на несколько
миллиметров, покрывая при этом и кончик микроэлектрода. Так как высокоомные
контакты образуются только с чистым стеклом, эту пленку необходимо удалять
только оплавлением микроэлектродов. При работе на мембранных фрагментах
используется несколько типов пипеток.
Пипетки из тугоплавкого стекла получили в практике большее применение,
чем пипетки из мягкого стекла. Первые имеют больше удельное сопротивление,
чем мягкое стекло с более низкой температурой плавления. Вследствие этого
вклад шума, обусловленного ёмкостью связи через стеклянную стенку в
пипетках с тугоплавким стеклом меньше.
Пипетки из толстостенного тугоплавкого стекла имеют ряд преимуществ. Во-
первых, при большей толщине стенок шунтирующая проводимость через стекло
меньше. Во-вторых, на некоторых препаратах гигаомные контакты более
стабильны и величина их образования значительно больше, чем для аналогичных
тонкостенных пипеток
Табл.1. Геометрические параметры
кончиков
пипеток, изготавливаемых
из различных
типов ст. капилляров
|Материал, из которого|Площадь |Площадь|Ширина |Угол |
|изготовлены пипетки |отверсти|кольца,|кольца,|конуса,|
| |ямкм2 |мкм2 | | |
| | | |мкм |град |
|Тонкостенные |1.0 |0,79 |0,19 |24 |
|капилляры CEE BEE – | | | | |
|мягкое стекло | | | | |
|Кимакс – твердое |1,2 |0,82 |0,2 |20 |
|боросиликатное стекло| | | | |
|Алюминиевое – твердое| 1,0|0,9 |0,22 |25 |
|алюмосиликатное | | | | |
|стекло | | | | |
|Тонкостенные |1,01 |1,71 |0,39 |10 |
|капилляры Jencons – | | | | |
|твердое | | | | |
|боросиликатное стекло| | | | |
Мембранные фрагменты
При работе с некоторыми клетками, например, с изолированными с помощью
ферментов клетками миокарда, гигаомные контакты иногда формируются
спонтанно, при прикосновении кончиком пипетки к поверхности клетки
высокоомный контакт формируется без подсасывания. В этом случае не
наблюдается никаких деформаций клеточных мембраны, и площадь мембранного
фрагмента можно оценить по значению сопротивления пипетки до образования
контакта. Но в большинстве случаев контакт формируется только при небольшом
разрежении, создаваемом внутри пипетки. При этом поверхность мембраны
деформируется, часть её втягивается внутрь пипетки на 2-3 мкм, принимая Q-
образную форму. Когда фрагмент изолируют механическим отведением кончика
пипетки от поверхности клетки, его У-образная форма практически не
изменяется. При дальнейшем подсасывании образуется сферический пузырёк.
Если известна удельная ёмкость мембраны (как правило, она составляет 1
мкф/см2), площадь фрагмента можно оценить по величине его ёмкости; обычно
площадь варьирует от 2 до 25 мкм2.
Электронные схемы для пэтч-кламп регистрации
Электронная схема пэтч-кламп регистрации должна иметь такие параметры,
чтобы было возможным зарегистрировать передвижение всего лишь нескольких
сотен элементарных электрических зарядов через малый участок клеточной
мембраны. При максимально сниженных собственных шумах измерительной
аппаратуры, токи через одиночные электровозбудимые Са-каналы, можно
зарегистрировать только в нефизиологических условиях – например, при
использовании растворов, содержащих Ва2+ вместо Са2+.
Стандартным методом измерения малых токов является регистрация
создаваемого ими падения напряжения на высокоомном сопротивлении. На рис.3
представлен три электрические цепи, с помощью которых осуществляются
подобные измерения. Наиболее удобно автоматическое поддержание требуемого
значения Vб с помощью операционного усилителя, который представляет собой
управляемый потенциалом источник напряжения ( рис.3, в).
Регистрация от целой клетки в условиях плотного контакта
Несмотря на то, что метод пэтч-кламп был разработан для регистрации токов
через одиночные каналы, пэтч-пипетки можно с успехом использовать также для
регистрации токов от целой клетки (РЦК), особенно когда размеры её
невелики. После образования гигаомного контакта мембранный фрагмент под
пипеткой можно разрушить, прикладывая к ней короткие импульсы
отрицательного давления. Такая манипуляция в большинстве случаев не
нарушает контакта пипетки с мембраной, и в результате между пипеткой и
содержимым клетки устанавливается хорошо изолированный от омывающего
раствора проводящий путь. Такой способ проникновения в клетку наносит ей
гораздо меньше повреждений, чем введение стандартного микроэлектрода.
Входное сопротивление небольших клеток велико по сравнению с эффективным
сопротивлением кончика пипетки, поэтому при работе с ними электрические
измерения можно проводить от участка мембраны намного большей площади, чем
у исходного фрагмента. В отличие от разных вариантов ПК регистрации этот
метод позволяет осуществить регистрацию от мембраны целой клетки, а не от
маленького мембранного фрагмента.
Для регистрации на целой клетке пэтч-пипетки заполняют соответствующим
раствором с низкой концентрацией ионов кальция. Пипетку прижимают к
поверхности клеточной мембраны, в результате чего формируется высокоомный
контакт. Затем потенциал пипетки изменяют до отрицательного значения и
подают импульсы напряжения с амплитудой в несколько милливольт. На этом
этапе производится компенсация быстрой ёмкостной компоненты, обусловленной
ёмкостью держателя и стенок пипетки. К пипетке прикладывают импульсы
отрицательного давления до тех пор, пока вновь не появятся ёмкостные
переходные процессы (возникает дополнительный ток).
Регистрацию от целой клетки можно проводить в течение часа без визуальных
или электрических признаков нарушения мембраны. Если исследуемая клетка
плотно прикрепилась к культуральной чашке, плавным отведением её от пипетки
можно получить конфигурацию outside-out. После такой процедуры клеточная
мембрана быстро “зашивается” и клетка является интактной. Но содержимое
клетки соответствует раствору в пипетке. Это используется в различных
целях:
1. для изменения содержимого выбранной клетки с минимальным повреждением
её мембраны.
2. Для проведения исследований с различными внутриклеточными растворами на
одной и той же клетке путем смены регистрирующих пипеток.
3. Для регистрации в одном эксперименте интегральных токов и одиночных
каналов.
Пипетки должны быть сравнительно широкими и иметь кончики с большим углом
схождения.
Между раствором в пипетке и содержимым клетки происходит быстрый обмен,
поэтому раствор для заполнения пипеток должен быть близок по своему составу
к клеточному содержимому.
Таб. 2. Типичные
электрические параметры,
получаемые при регистрации
на хромафинных
клетках в конфигурации РЦК
|Последовательное сопротивление, |4 МОм |
|Rs | |
|Ёмкость клетки, C |5 пФ |
|Пост. Времени фиксации |20 мкс |
|потенциала, RsC | |
|Пост. Времени обмена ионов, tоб|5с |
|Сопротивление клетки, R |10ГОм |
|Сопротивление утечки, Rут |20ГОм |
|Шум (среднеквадр. значение, 0-400|0,15 пА |
|Гц) | |
Данные таблицы отличаются от значений, полученных с обычными стеклянными
микроэлектродами по трем основным пунктам:
1. большинство клеток с диаметром менее 20 мкм при прокалывании обычным
микроэлектродом повреждается, в то время как РЦК можно проводить даже на
клетках диаметром менее 10 мкм, совершенно не нарушая их.
2. Сопротивление утечки микроэлектрод-клетка при использовании обычных
микроэлектродов не превышает 500 МОм, в то время как соответствующее
значение сопротивления утечки при РЦК могут быть 20 ГОм и более.
3. Обычные микроэлектроды имеют сопротивление кончика Rs более 100 МОм, а
типичные значения для РЦК на хромафинных клетках составляют 4 МОм.
Метод РЦК применяется для регистрации токов в мембране опухолевых клеток
гипофиза, внутренних сегментов палочек сетчатки, островковых клеток
поджелудочной железы, клеток миокарда, наружных сегментов палочек сетчатки,
нейронов спинного мозга млекопитающих и др.
Пэтч-кламп регистрация при неплотном контакте
Метод регистрации от целой клетки в условиях плотного контакта позволяет
регистрировать ионные токи, протекающие через небольшие мембранные
фрагменты, которые содержат только один или несколько ионных каналов. Для
получения информации о кинетике работы каналов или о плотности токов через
мембрану проводится одновременная регистрация работы множественных каналов
с использованием метода пэтч-кламп или применяется классический метод
фиксации мембранного потенциала.
Регистрация при неплотном контакте по сути идентична регистрации одиночных
каналов, за исключением того, что участок мембраны, на котором фиксируется
потенциал, на 3 порядка больше, и при этом не требуется формирования
гигаомных контактов.
Метод позволяет без труда получать стабильные электрофизиологические
данные от локальных участков мембраны, используя интактные клетки
практически без их изоляции или других видов обработки. Например, можно
проводить измерения на целой мышце, не выделяя одиночные клетки. Отпадает
необходимость и в использовании внутриклеточных микроэлектродов.
Однако, необходимо отметить, что наиболее корректную информацию о
мембранной проводимости всё-таки даёт регистрация токов через одиночные
каналы, так как позволяет избавиться от ряда артефактов, которые могут быть
получены при регистрации макроскопического тока. Имеются, по крайней мере,
четыре основные проблемы, с которыми приходится сталкиваться при
регистрации макроскопических токов. Во-первых, трудно создать условия для
регистрации тока только через каналы интересующего нас типа. Во-вторых,
влияние последовательного сопротивления
может приводить к различию между истинным мембранным и поддерживаемым
потенциалом. В-третьих, накопление ионов в примембранной области может
вызывать зависящее от времени изменение тока через отдельные каналы. И,
наконец, потенциал-зависимость проводимости открытого канала может быть
ошибочно принята за потенциал-зависимость активации канала.
Литература:
1. Медведев С.С. Электрофизиология растений. – СПб.: Изд-во
С-Петебург. ун-та, 1998. – 184 с.
2. Регистрация одиночных каналов / под ред. Сакмана Б. и
Неера Э. – М.: “Мир”, 1991
3. Эккерт Р., Рэнделл.Д, Огастин Дж. – Физиология животных,
механизмы и адаптация. – М.: “Мир”,1991
4. Hedrich R., Schroeder.J.I. and Fernandez J.M. – Patch-clamp studies
on higher plant cells: a perspective. // Trends biochemistry science.
– 1987. – v.12. pp. 49-52&
-----------------------
[pic]
[pic]
[pic]
[pic]
Реферат на тему: Методы исследования в цитологии
Мурманский государственный технический университет
Кафедра
биологии
Доклад на тему:
"Методы исследования в цитологии"
Выполнил:
Студентка 1-го курса
Технического факультета
Кафедры Биология
Серебрякова Лада Вячеславовна
Проверил:
Мурманск 2001
План:
1. Что изучает цитология.
2. Представление о том, что организмы состоят из клеток.
3. Методы исследования, применяемые в цитологии.
4. Фракционирование клеток.
5. Радиоавтография.
6. Определение продолжительности некоторых стадий клеточного цикла методом
радиоавтографии.
Цитология – наука о клетке. Из среды других биологических наук она
выделилась почти 100 лет назад. Впервые обобщенные сведения о строении
клеток были собраны в книгу Ж.-Б. Карнуа «Биология клетки», вышедшей в
1884 году. Современная цитология изучает строение клеток, их
функционирование как элементарных живых систем: исследуются функции
отдельных клеточных компонентов, процессы воспроизведения клеток, их
репарации, приспособление к условиям среды и многие другие процессы,
позволяющие судить об общих для всех клеток свойствах и функциях. Цитология
рассматривает также особенности строения специализированных клеток. Другими
словами, современная цитология – это физиология клетки. Цитология тесно
сопряжена с научными и методическими достижениями биохимии, биофизики,
молекулярной биологии и генетики. Это послужило основанием для углубленного
изучения клетки уже с позиций этих наук и появления некой синтетической
науки о клетке – биологии клетки, или клеточной биологии. В настоящее время
термины цитология и биология клетки совпадают, так как их предметом
изучения является клетка с ее собственными закономерностями организации и
функционирования. Дисциплина «Биология клетки» относится к фундаментальным
разделам биологии, потому что она исследует и описывает единственную
единицу всего живого на Земле – клетку.
Длительное и пристальное изучение клетки как таковой привело к
формулированию важного теоретического обобщения, имеющего общебиологическое
значение, а именно к появлению клеточной теории. В XVII в. Роберт Гук,
физик и биолог, отличавшийся большой изобретательностью, создал микроскоп.
Рассматривая под своим микроскопом тонкий срез пробки, Гук обнаружил, что
она построена из малюсеньких ничем не заполненных ячеек, разделенных
тонкими стенками, которые, как это нам теперь известно, состоят из
целлюлозы. Он назвал эти маленькие ячейки клетками. В дальнейшем, когда
другие биологи начали исследовать под микроскопом растительные ткани,
оказалось, что маленькие ячейки, обнаруженные Гуком в мертвой иссохшей
пробке, имеются и в живых растительных тканях, но у них они не пустые, а
содержат каждая по маленькому студенистому тельцу. После того, как
микроскопическому исследованию подвергли животные ткани, было установлено,
что они также состоят из мелких студенистых телец, но что эти тельца лишь
в редких случаях отделены друг от друга стенками. В результате всех этих
исследований в 1939 г. Шлейден и Шванн независимо друг от друга
сформулировали клеточную теорию, гласящую, что клетки представляют собой
элементарные единицы, из которых в конечном счете построены все растения и
все животные. В течение какого-то времени двоякий смысл слова клетка еще
вызывал некоторые недоразумения, но затем он прочно закрепился за этими
маленькими желеобразными тельцами.
Современное представление о клетке тесно связано с техническими
достижениями и усовершенствованиями методов исследования. Помимо обычной
световой микроскопии, не утратившей своей роли, в последние несколько
десятилетий большое значение приобрели поляризационная, ультрафиолетовая,
флюоресцентная, фазовоконтрастная микроскопия. Среди них особое место
занимает электронная микроскопия, разрешающая способность которой позволила
проникнуть и изучить субмикроскопическую и молекулярную структуру клетки.
Современные методы исследования позволили вскрыть детальную картину
клеточной организации.
Каждая клетка состоит из ядра и цитоплазмы, отделенных друг от друга
и от внешней среды оболочками. Компонентами цитоплазмы являются: оболочка,
гиалоплазма, эндоплазматическая сеть и рибосомы, аппарат Гольджи, лизосомы,
митохондрии, включения, клеточный центр, специализированные органеллы.
Часть организма, выполняющая какую-то особую функцию, называют
органом. Любой орган – легкое, печень, почка, например – имеет каждый свою
особую структуру, благодаря которой он играет определенную роль в
организме. Точно так же в цитоплазме имеются особые структуры, своеобразное
строение которых дает им возможность нести определенные функции,
необходимые для метаболизма клетки; эти структуры называют органеллами
(«маленькими органами»).
Выяснение природы, функции и распределения органелл цитоплазмы стало
возможным лишь после развития методов современной биологии клетки. Наиболее
полезными в этом отношении оказались: 1) электронная микроскопия; 2)
фракционирование клеток, с помощью которого биохимики могут выделять
относительно чистые фракции клеток, содержащие определенные органеллы, и
изучать, таким образом, отдельные интересующие их метаболические реакции;
3) радиоавтография, сделавшая возможным непосредственное изучение отдельных
метаболических реакций, протекающих в органеллах.
Метод, с помощью которого органеллы выделяют из клеток, называют
фракционированием. Этот метод оказался очень плодотворным, дав биохимикам
возможность выделять разные органеллы клетки в относительно чистом виде.
Он позволяет, кроме того, определять химический состав органелл и
содержащиеся в них ферменты и на основании получаемых данных делать выводы
об их функциях в клетке. В качестве первого шага клетки разрушают путем
гомогенизации в какой-нибудь подходящей среде, которая обеспечивает
сохранность органелл и предотвращает их агрегацию. Очень часто для этого
используют раствор сахарозы. Хотя митохондрии и многие другие клеточные
органеллы остаются при этом неповрежденными, такие мембранные переплетения,
как эндоплазматический ретикулум, а также плазматическая мембрана,
распадаются на фрагменты. Однако образующиеся фрагменты мембран нередко
замыкаются сами на себя, в результате чего получаются округлые пузырьки
различных размеров.
На следующем этапе клеточный гомогенат подвергают ряду
центрифугирований, скорость и продолжительность которых всякий раз
возрастает; этот процесс называется дифференциальным центрифугированием.
Разные органеллы клетки осаждаются на дне центрифужных пробирок при
различных скоростях центрифугирования, что зависит от размеров, плотности и
формы органелл. Образующийся осадок можно отобрать и исследовать. Быстрее
всех осаждаются такие крупные и плотные структуры, как ядра, а для
осаждения более мелких и менее плотных структур, таких, как пузырьки
эндоплазматического ретикулума, требуются более высокие скорости и более
длительное время. Поэтому при низких скоростях центрифугирования ядра
осаждаются, а другие клеточные органеллы остаются в суспензии. При более
высоких скоростях осаждаются митохондрии и лизосомы, а при длительном
центрифугировании и очень высоких скоростях в осадок выпадают даже такие
мелкие частицы, как рибосомы. Осадки можно исследовать с помощью
электронного микроскопа, чтобы определить чистоту полученных фракций. Все
фракции до некоторой степени загрязнены другими органеллами. Если тем не
менее удается добиться достаточной чистоты фракций, то их подвергают затем
биохимическому анализу, чтобы определить химический состав и ферментативную
активность выделенных органелл.
Сравнительно недавно был создан другой метод фракционирования клеток
– центрифугирование в градиенте плотности; при этом центрифугирование
производят в пробирке, в которой предварительно наслаивают друг на друга
растворы сахарозы все возрастающей концентрации, а следовательно, и
возрастающей плотности. При центрифугировании содержащиеся в гомогенате
органеллы располагаются в центрифужной пробирке на тех уровнях, на которых
находятся растворы сахарозы, соответствующие им по плотности. Этот метод
дает биохимикам возможность разделять органеллы одинаковых размеров, но
разной плотности (рис. 1.).
[pic]
Радиоавтография – сравнительно новый метод, безмерно расширивший
возможности как световой, так и электронной микроскопии. Это в высшей
степени современный метод, обязанный своим возникновением развитию ядерной
физики, которое сделало возможным получение радиоактивных изотопов
различных элементов. Для радиоавтографии необходимы, в частности, изотопы
тех элементов, которые используются клеткой или могут связываться с
веществами, используемыми клеткой, и которые можно вводить животным или
добавлять к культурам в количествах, не нарушающих нормального клеточного
метаболизма. Поскольку радиоактивный изотоп (или помеченное им вещество)
участвует в биохимических реакциях так же, как его нерадиоактивный аналог,
и в то же время испускает излучение, путь изотопов в организме можно
проследить с помощью различных методов обнаружения радиоактивности. Один из
способов обнаружения радиоактивности основан на ее способности действовать
на фотопленку подобно свету; но радиоактивное излучение проникает сквозь
черную бумагу, используемую для того, чтобы защитить фотопленку от света, и
оказывает на пленку такое же действие, как свет.
Чтобы на препаратах, предназначенных для изучения с помощью светового
или электронного микроскопов, можно было обнаружить излучение, испускаемое
радиоактивными изотопами, препараты покрывают в темном помещении особой
фотоэмульсией, после чего оставляют на некоторое время в темноте. Затем
препараты проявляют (тоже в темноте) и фиксируют. Участки препарата,
содержащие радиоактивные изотопы, воздействуют на лежащую над ними
эмульсию, в которой под действием испускаемого излучения возникают темные
«зерна». Таким образом, получают радиоавтографы (от греч. радио –
лучевидный, аутос – сам и графо – писать).
Вначале гистологи располагали лишь несколькими радиоактивными
изотопами; так, например, во многих ранних исследованиях с применением
радиоавтографии использовался радиоактивный фосфор. Позднее стали
использовать значительно больше таких изотопов; особенно широкое применение
нашел радиоактивный изотоп водорода – тритий.
Радиоавтография имела и имеет до сих пор очень широкое применение для
изучения того, где и как в организме протекают те или иные биохимические
реакции.
Химические соединения, меченые радиоактивными изотопами, которые
используются для исследования биологических процессов, называют
предшественниками. Предшественники – это обычно вещества, подобные тем,
которые организм получает из пищи; они служат строительными блоками для
построения тканей и включаются в сложные компоненты клеток и тканей таким
же образом, как в них включаются немеченые строительные блоки. Компонент
ткани, в который включается меченый предшественник и который испускает
излучение, называется продуктом.
Клетки, выращиваемые в культуре, хотя и принадлежат к одному и тому
же типу, в любой данный момент времени будут находиться на разных стадиях
клеточного цикла, если не принять специальных мер для синхронизации их
циклов. Тем не менее, путем введения в клетки тритий-тимидина и
последующего изготовления радиоавтографов можно определить
продолжительность различных стадий цикла. Время наступления одной стадии –
митоза – можно определить и без меченого тимидина. Для этого выборку клеток
из культуры держат под наблюдением в фазово-контрастном микроскопе, который
дает возможность непосредственно следить за течением митоза и устанавливать
его сроки. Продолжительность митоза обычно равна 1 ч, хотя в клетках
некоторых типов он занимает до 1.5 ч.
Определение продолжительности G 2-периода.
Для определения продолжительности G 2–периода применяют метод,
известный под названием импульсной метки: к культуре клеток добавляют
меченый тимидин, а спустя короткое время заменяют культуральную среду
свежей, с тем, чтобы предотвратить дальнейшее поглощение клетками меченого
тимидина. При этом метку включают только в те клетки, которые в течение
кратковременного пребывания в среде с тритий-тимидином находились в S-
периоде клеточного цикла. Доля таких клеток невелика и лишь небольшая часть
клеток получит метку. Кроме того, все клетки, включающие метку, будут
находиться в интерфазе – от клеток, едва вступивших в S-период, до таких,
которые почти закончили его за время воздействия тритий-тимидина. В пробе,
взятой сразу после удаления меченого тимидина, метка содержится только в
интерфазных ядрах, принадлежащих клеткам, которые в период воздействия
метки находились в S-периоде; те же клетки, которые в этот период
находились в состоянии митоза, остаются немечеными.
Если затем продолжать отбирать из культуры пробы через определенные
промежутки времени и изготовлять для каждой последовательной пробы
радиоавтограф, то наступит момент, когда метка начнет появляться в
митотических d-хромосомах. Метки будут включаться во все те клетки,
которые в период наличия в среде тритий-тимидина находились в S-периоде,
причем среди этих клеток будут как только что вступившие в S-период, так и
почти закончившие его. Совершенно очевидно, что эти последние первыми среди
меченых клеток проделают митоз и, следовательно, в их митотических
хромосомах обнаружится метка. Тем самым промежуток между 1) временем, когда
из культуры был удален меченый тимидин, и 2) временем появления меченых
митотических хромосом будет соответствовать продолжительности G 2–периода
клеточного цикла.
Определение продолжительности S-периода.
Поскольку клетки, находящиеся в момент введения в среду метки в самом
конце S-периода, первыми вступят в митоз, то, следовательно, в тех клетках,
у которых S-период начинается непосредственно перед удалением метки,
меченые митотические хромосомы появятся в последнюю очередь. Поэтому, если
бы нам удалось определить промежуток между временем вступления в митоз
клеток, помеченных первыми, и клеток, помеченных последними, мы установили
бы продолжительность S-периода. Однако, хотя время, когда впервые
появляются меченые митотические хромосомы, установить легко, время
вступления в митоз клеток, помеченных последними, определить невозможно
(этому препятствует очень большое количество меченых делящихся клеток в
последних пробах). Поэтому продолжительность S-периода приходится
определять другим способом.
При исследовании радиоавтографов последовательных проб клеток,
отбираемых через одинаковые промежутки времени, обнаруживается, что доля
клеток, несущих метку в своих митотических хромосомах, постепенно
возрастает, пока мечеными не окажутся буквально все делящиеся клетки.
Однако, по мере того как клетки одна за другой завершают митоз, они
превращаются в меченые интерфазные клетки. Первыми завершают митоз те из
меченых клеток, которые вступили в него первыми; и соответственно из клеток
с мечеными митотическими хромосомами последними завершают митоз те, которые
вступили в него позже всех. Поскольку продолжительность митоза всегда
одинакова, то, следовательно, если бы мы могли определить промежуток между:
1) временем окончания митоза в клетках, включивших метку первыми, и 2)
временем окончания митоза в клетках, включивших метку последними, мы
установили бы продолжительность S-периода. Продолжительность S-периода
нетрудно установить, определив промежуток между: 1) моментом времени, когда
50% митотических клеток в культуре несут метку, и 2) моментом времени,
после которого культура уже не содержит 50% меченых клеток.
Определение времени генерации (общей продолжительности всего
клеточного цикла).
Продолжая отбирать из культуры пробы клеток, можно обнаружить, что
меченые фигуры митоза в какой-то момент совершенно исчезают, а затем
появляются вновь. Такие делящиеся клетки представляют собой дочерние
клетки, происходящие от тех материнских клеток, которые включили метку,
находясь в момент воздействия тритий-тимидина в S-периоде. Эти материнские
клетки перешли в S-период, разделились, а затем прошли через вторую
интерфазу и второе деление, то есть проделали один полный цикл и часть
следующего. Время, необходимое для прохождения полного клеточного цикла,
называется временем генерации. Оно соответствует промежутку между двумя
последовательными пиками включения метки и обычно соответствует отрезку
между теми точками последовательных восходящих кривых, в которых 50% фигур
митоза содержат метку.
Литература.
А.Хэм, Д.Кормак «Гистология», том 1 Москва «МИР» 1982;
М.Г.Абрамов «Клиническая цитология» Москва «МЕДИЦИНА» 1974;
Ю.С.Ченцов «Общая цитология»
| |
