GeoSELECT.ru



Биология / Реферат: Получение моноклональных антител (Биология)

Космонавтика
Уфология
Авиация
Административное право
Арбитражный процесс
Архитектура
Астрология
Астрономия
Аудит
Банковское дело
Безопасность жизнедеятельности
Биология
Биржевое дело
Ботаника
Бухгалтерский учет
Валютные отношения
Ветеринария
Военная кафедра
География
Геодезия
Геология
Геополитика
Государство и право
Гражданское право и процесс
Делопроизводство
Деньги и кредит
Естествознание
Журналистика
Зоология
Инвестиции
Иностранные языки
Информатика
Искусство и культура
Исторические личности
История
Кибернетика
Коммуникации и связь
Компьютеры
Косметология
Криминалистика
Криминология
Криптология
Кулинария
Культурология
Литература
Литература : зарубежная
Литература : русская
Логика
Логистика
Маркетинг
Масс-медиа и реклама
Математика
Международное публичное право
Международное частное право
Международные отношения
Менеджмент
Металлургия
Мифология
Москвоведение
Музыка
Муниципальное право
Налоги
Начертательная геометрия
Оккультизм
Педагогика
Полиграфия
Политология
Право
Предпринимательство
Программирование
Психология
Радиоэлектроника
Религия
Риторика
Сельское хозяйство
Социология
Спорт
Статистика
Страхование
Строительство
Схемотехника
Таможенная система
Теория государства и права
Теория организации
Теплотехника
Технология
Товароведение
Транспорт
Трудовое право
Туризм
Уголовное право и процесс
Управление
Физика
Физкультура
Философия
Финансы
Фотография
Химия
Хозяйственное право
Цифровые устройства
Экологическое право
   

Реферат: Получение моноклональных антител (Биология)



Министерство образования Российской Федерации
Самарский Государственный Университет



Реферат на тему:

ПОЛУЧЕНИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ



Выполнила студентка 542 Б группы
биологического факультета СамГУ
Миронова Ирина



Самара
2001
Введение

Для многих исследований, связанных с изучением биологических структур
большую ценность представляют реагенты, способных специфически
взаимодействовать с данной структурой. Универсальным реагентом, обладающим
указанным свойством, считается молекула иммуноглобулина. Несмотря на то,
что иммуноглобулины, являясь антителами, взаимодействуют только с
антигеном, то есть с молекулой способной вызвать иммунный ответ, для
большинства структур удается подобрать условия, при которых они становятся
антигенами и индуцируют выработку комплиментарных антител (например, при
конъюгации с сильными иммуногенами). Именно этим объясняется большое
распространение иммунологических методов, связанных с использованием
антител, в различных областях биологии и медицины.
Серьезную проблему при применении антисывороток для идентификации и
количественного определения антигенов в различных областях исследований
представляет неспецифическое связывание и перекрестная реактивность
антител.

История создания метода

Многие исследователи пытались отыскать способы получения антител с
узкой специфичностью. Так, при определенных условиях иммунизации
бактериальными полисахаридами удается получить высокогомогенный аппарат
антител с узкой специфичностью. Кроме того, возможно слияние плазмацитомы
(опухоли, возникшей из антителообразующей клетки или ее предшественника) с
клетками селезенки иммунизированного животного, получив таким образом
гибридные клетки (гибридомы), унаследовавшие от опухолевых клеток
способность неограниченно размножаться, а от клеток селезенки –
синтезировать антитела предопределенной специфичности.
Предпосылками для возникновения метода получения гибридом,
синтезирующих моноклональные антитела, были разработки двух
методологических подходов:
1) получение миелом, адаптация их к условиям культивирования вне
организма;
2) метод соматической гибридизации клеток.
У мышей довольно легко получить миеломы (плазмацитомы). Эти опухоли
являются потомками одной клетки (то есть имеют моноклональное
происхождение) и секретируют уникальные иммуноглобулины, некоторые из
которых могут взаимодействовать с известными антигенами. Опухоли индуцируют
у животных путем внутрибрюшинного введения минеральных масел или инертного
твердого пластика. Для возникновения миелом большое значение имеет
генетический статус животного, и только у двух линий инбредных мышей
экспериментаторам удалось получить такие опухоли.
Миеломные клетки мыши оказались чрезвычайно удобными для изучения биохимии
продукции иммуноглобулинов и дали очень многое для понимания структуры,
механизмов секреции и их функции. Однако, миеломная система как источник
антител к большинству антигенов не оправдала надежды исследователей – не
удавалось иммунизировать животных, а затем получить мышиные миеломы,
продуцирующие антитела к иммунизирующие антигену. Из тысяч миеломных
опухолей, индуцированных у мышей, лишь единичные вырабатывали
иммуноглобулины, которые реагировали с известными антигенами, что было
обнаружено путем грубого скринирования с множеством потенциальных
антигенов. Таким образом, миеломные белки оказывались с неизвестной
антигенной специфичностью.
Другой предпосылкой возникновения метода получения гибридом явилась техника
гибридизации соматических клеток, разработка которых широко проводилась
после открытия феномена спонтанной гибридизации. При слиянии плазматических
мембран клеток образуются клетки с двумя или большим числом ядер –
гетерокарионы. После первого деления ядра сливаются и образуется одно ядро
с набором хромосом от всех слившихся партнеров – образуется гибридная
клетка. Низкую частоту образования гибридов можно было увеличить,
использовав ряд агентов, вызывающих слияние: вирус Сендай, лизолецитин,
полиэтиленгликоль.
Даже при использовании агентов, повышающих слияние, частота образующихся
гибридов крайне низка. Для их выделения необходимы селективные среды,
позволяющие расти преимущественно образовавшимся гибридам. В настоящее
время разработано несколько принципов селекции гибридных клеток. Одним из
наиболее распространенных является метод, основанный на применении системы,
содержащей гипоксантин, амидоптерин и тимидин (система ГАТ).
Селекция гибридных клеток основана на том, что в ГАТ среде родительские
миеломные клетки погибают, а нормальные клетки селезенки не обладают
способностью расти при данных условиях культивирования, так что выживают и
размножаются только гибридные клетки, унаследовавшие от родительских клеток
способность размножаться и синтезировать специфические иммуноглобулины.

Подготовительные этапы перед проведением слияния

Полностью процедура получения моноклональных антител включает в себя
следующие этапы:
иммунизация животных;
подготовка клеток к слиянию;
слияние;
отбор индуцирующих специфические антитела клонов;
клонирование и реклонирование;
массовая наработка гибридомных клеток;
получение культуральной жидкости или асцита, содержащих антитела;
выделение антител.
Обычно вся процедура от момента начала иммунизации до выделения антител
занимает 3-4 месяца.
Организация работы и оборудование. Для работы по получению гибридом
желательно выделить отдельное помещение. Эксперимент можно проводить и в
части большой комнаты, максимально удаленной от входной двери. Это
помещение надо оснастить следующим оборудованием:
Ламинарный бокс с вертикальной или горизонтальной подачей стерильного
воздуха. Стерильность обеспечивается наличием фильтров, задерживающих
частицы крупнее 0,3 мкм.
Инкубатор, в котором автоматически поддерживается влажность, температура и
концентрация СО2.
Низкоскоростная центрифуга с подвесными стаканами, желательно с
охлаждением.
Обычный и инвертированный микроскопы с фазово-констрастным устройством.
Холодильник на +4 и на –200 С.
Водяная баня на +37 и +560 С.
Помимо этого в отдельном помещении желательно иметь морозильник на –700 С и
сосуд Дьюара с жидким азотом для хранения клеток. Для получения гибридом
нужно приобрести также специальную пластиковую посуду для культуры клеток:
96-луночные планшеты с плоским дном, 24-луночные планшеты, флаконы с
площадью роста 25, 75 см2 и др., пластиковую посуду для проведения
иммуноферментного и радиоиммунологического анализов, среды для
культивирования, необходимые реактивы, сыворотку плода коровы (СПК).
Приготовление отдельных компонентов сред для культивирования. Основными
средами, употребляемыми для получения гибридом, являются среда RPMI 1640 и
среда Игла в модификации Дульбекко. Применяются и другие среды, в
частности, среда Дульбекко в модификации Иксова. Среды выпускаются в виде
готовых растворов, 10-кратных концентратов и сухих порошков. Лучшие
результаты получаются при приготовлении сред в условиях лаборатории из
сухих порошков, однако при этом важное значение имеет качество воды. Для
приготовления сред необходима деионизированная и дважды перегнанная в
кварцевой посуде вода.
Выбор экспериментального животного. Обычно для иммунизации используют мышей
и крыс. Это связано с тем, что подходящие миеломные клетки мышей и крыс
широко распространены и, кроме этого, не представляет сложностей
выращивание полученных гибридом в организме этих животных.
Другие животных практически не используются.
При иммунизации животных иммунный ответ вырабатывается на все антигенные
детерминанты всех компонентов вводимого материала. Это значительно
осложняет отбор клонов, продуцирующих антитела к интересующей антигенной
детерминанте, так как их доля может быть крайне незначительной. Поэтому по
возможности для иммунизации применяют очищенные антигены, по крайней мере
на последних этапах иммунизации. Одним из основных достоинств гибридомной
техники и является как раз то обстоятельство, что специфические антитела
против данного антигена можно получить, взяв для иммунизации неочищенный
препарат антигена, и употребив впоследствии эти антитела для очистки
антигена.
Способы иммунизации. Назначение процесса иммунизации состоит в том, чтобы
увеличить долю клеток, продуцирующих антитела заданной специфичности, и
перевести эти клетки в функциональное состояние, при котором они способны
сливаться и образовывать антителообразующие гибридные клетки.
Экспериментально установлено, что для гибридизации необходимы выделять
селезеночные клетки животных через 3-4 суток после последнего введения
антигена, то есть тогда, когда в лимфоидных органах много активно
пролиферирующих клеток.
Конкретная схема иммунизации сильно зависит от природы антигена и его
иммуногенности. Антигены клеточной поверхности являются сильными
иммуногенами, тогда как большинство растворимых белков – слабые иммуногены.
В последнем случае необходимо применять различные адъюванты, усиливающие
иммунный ответ. Среди адъювантов наибольшее распространение получил полный
адъювант Фрейнда (ПАФ). Помимо этого, используют введение антигена,
преципитированного на квасцах, и введение вместе с антигеном убитых клеток
Bordetella Pertussis. Обычно антиген вводят неоднократно, что необходимо
для развития сильного иммунного ответа, хотя чрезмерная иммунизация может
иметь обратный эффект – отмечено, что иногда у клеток гипериммунизированных
животных снижается способность образовывать гибридомы. В некоторых случаях
бывает достаточно и одной иммунизации.
По ходу иммунизации необходимо определять титр антител к антигену (титр
антител – величина, обратная разведению сыворотки, при которой степень
иммунологической реакции снижается в два раза по сравнению с максимальной).
Обычно это делают перед последней иммунизацией. В опыт набирают животных с
высоким титром антител. Не следует ожидать хороших результатов
гибридизации, если при иммунизации животных нет образования антител или они
образуются в низком титре.
Для большинства растворимых антигенов можно использовать следующую схему
иммунизации.
Вводят 1-100 мкг антигена в ПАФ или в виде преципитата на квасцах
внутрибрюшинно. Если есть возможность, то одновременно вводят 2*109 убитых
клеток B. Pertussis.
Через 2-3 недели вводят антиген на физиологическом растворе внутрибрюшинно
или внутривенно. Эту процедуру можно повторять до появления высокого титра
антител.
Последнюю иммунизацию делают внутривенно, через 3 суток животные
забиваются, и готовится суспензия клеток для гибридизации.
При применении в качестве иммуногена различных клеток (опухолевые клетки,
чужеродные клетки крови, бактерии, паразиты и т.д.) делают несколько
инъекций без адъюванта внутрибрюшинно с интервалом в 2-3 недели по (1-
5)*107 клеток. Последнюю инъекцию делают внутривенно и через 3 дня выделяют
клетки селезенки для гибридизации.
В последнее время активно развиваются методы полной иммунизации вне
организма с целью получения гибридомы. Иммунизация in vitro имеет ряд
существенных преимуществ:
укорачивается период иммунизации до 4-5 суток;
требуется существенно меньшее количество антигена;
ко многим антигенам можно получить более выраженный иммунный ответ
(частично за счет снижения вклада толерантности и супрессии);
повышается процент отвечающих клеток;
легко проверять факторы, влияющие на эффективность иммунизации.
Современные методы иммунизации in vitro основаны на двух системах
культивирования лимфоцитов, разработанных в конце 1960-х годов. Метод
суспензионного культивирования был первым методом, в котором иммунизация
полностью проходила вне организма. Критическими факторами в данном методе
были низкая концентрация кислорода в атмосфере (7%), высокая плотность
клеток, легкое покачивание культуры, ежедневное добавление свежей среды и
выбор подходящей партии СПК и антигена (использовали эритроциты барана).
Другой основной системой иммунизации in vitro является метод Д. Марбрука.
Клетки культивируют в маленькой камере на диализной мембране, через которую
идет обмен средой из большого резервуара.
Одним из основных недостатков иммунизации in vitro является доля IgM-
образующих клонов. Это связано с тем, что при иммунизации in vivo клетки
берут во время вторичного иммунного ответа, при котором образуются в
основном антитела IgG класса, тогда как in vitro реакция идет по первичному
типу, для которого характерна продукция IgM антител. Эта проблема может
быть преодолена после отработки способов получения вторичного иммунного
ответа in vitro.

Слияние

Существуют два основных варианта добавления ПЭГ, используемых в настоящее
время. Первый метода заключается в следующем. В течение 1 мин добавляют 1
мл 50% раствора ПЭГ при 370 С с постоянным перемешиванием. Затем раствор
постепенно разбавляют до 10 мл в течение нескольких минут средой без
сыворотки, после чего клетки центрифугируют и ресуспендируют в среде
культивирования.
Во втором методе используют более длительную обработку клеток раствором
ПЭГ. К осадку клеток добавляется 30-35% ПЭГ при комнатной температуре.
Клетки центрифугируют 2 мин, затем их оставляют при комнатной температуре
еще на 5-7 мин. Затем их разводят в большом объеме среды с сывороткой,
обмывают и культивируют.

Клонирование гибридомных клеток

Клонирование осуществляется для выделения стабильных клонов гибридомных
клеток. Для недавно образованных гибридомных клеток характерна высокая
нестабильность, связанная с утратой хромосом. При культивировании могут
появляться клетки, потерявшие способность продуцировать антитела и они
могут перерастать антителообразующие гибридные клетки.
К основным методам клонирования клеток относятся клонирование методом
лимитирующих разведений, клонирование в полужидком агаре и клонирование с
помощью прибора – проточного цитофлуориметра.
Клонирование методом лимитирующих разведений. Если клетки посеяны в 96-
луночные планшеты очень редко, то доля лунок, в которой наблюдается рост
клеток, подчиняется распределению Пуассона:
[pic]
где f (0) – фракция лунок, в которых отсутствует рост; ( – среднее число
клеток на лунку.
При ( = 1 f (0) = 0,37. Для того, чтобы получить разумную вероятность
только одного клона в лунке, в более 37% лунок не должно наблюдаться роста
клеток. Поскольку эффективность клонирования редко бывает равной 100%,
клетки необходимо засевать при плотности 10, 3 и 0,5 клеток на лунку. В тех
планшетах, на которых наблюдается рост в половине лунок, содержатся
изолированные клоны.
При первом клонировании активной может оказаться только небольшая часть
клонов. Необходимо всегда производить повторное клонирование, при котором
доля положительных клонов будет возрастать.
Для клонирования надо применять клетки питающего слоя. Используются те же
виды клеток, что и для начального роста гибридом.
Клонирование в полужидком агар-агаре. Для клонирования гибридом можно
применять полужидкий агар. Обычно берется система, состоящая из двух слоев.
Нижний (твердый) слой содержит 0,5% агар-агара в среде культивирования. Ему
дают затвердеть. Затем добавляют второй слой – мягкий, содержащий 0,3% агар-
агара, в который включаются клонируемые клетки. При использовании клеток
питающего слоя их засевают в чашку Петри до заливки агар-агара, и среду
культивирования удаляют непосредственно перед добавлением нижнего слоя
агара.
Колонии становятся видимыми через 7-14 суток, их переносят на жидкую
культуру.
Клонирование с помощью проточного цитофлуориметра. Приготавливают
флуоресцентные микрошарики из латекса и покрывают их антигеном. Такие
шарики адсорбируются на антигенспецифических гибридомных клетках, что
позволяет выделять их на этом приборе.
После выделения тем или иным способом положительных клонов, клетки этих
клонов размножают в достаточном количестве и образцы их замораживаются.

Массовая наработка моноклональных антител

После отбора гибридомных клеток, синтезирующих интересующие исследователя
антитела, можно приступить к их массовому наращиванию с целью получения
больших количеств моноклональных антител. В начале культивирования
гибридомные клетки могут расти медленно и плохо переносить низкую плотность
посева. В связи с этим при пересеве клеток их надо разводить не более чем в
3-5 раз. Ускорению роста клеток может способствовать добавление клеток
питающего слоя. Гибридомные клетки необходимо поддерживать в
логарифмической фазе роста и избегать повышения концентрации клеток выше
0,5 млн/мл. Клетки можно культивировать как в стационарной культуре, так и
в роллерной, а также в различного рода культиваторах (ферментерах).
Для получения максимальной продукции моноклональных антител клеткам
позволяют расти до предельной плотности. В такой культуре через
определенное время наблюдается гибель гибридомных клеток. Надосадочная
жидкость собирается, а клеточный осадок отбрасывается, то есть не пытаются
культивировать дальше оставшиеся живые клетки.
Для получения больших количеств антител вводят гибридомные живые клетки в
организм животных и получают от них асцитную жидкость. Предварительно
животным вводят агенты, повышающие способность гибридом расти в брюшной
полости. В качестве такого агента чаще всего выступает пристан – 0,5 мл за
10-14 суток до введения клеток.

Очистка антител

Для многих целей не требуется очистка антител, и они используются в виде
культуральных жидкостей или асцитных жидкостей. Грубую иммуноглобулиновую
фракцию можно получить высаливанием белков сульфатом аммония с последующим
диализом. Если антитела необходимо выделить в чистом виде, то
предварительно определяют их класс и подкласс, так как способы очистки
различаются для антител разных классов. Это можно сделать с помощью метода
иммунодиффузии по Ухтерлони.
Выделение чистых антител лучше всего проводить на иммуносорбентах. При этом
методе, однако, есть опасность, что при фиксации изменяется антигенная
структура клеточной поверхности.
Если не удается выделить антитела прямым способом, то получают
иммуноглобулиновую фракцию с помощью различных методов аффинной и
ионообменной хроматографии на сефарозес пришитым ковалентно белком А.

Заключение

Одна из задач клеточной инженерии состоит в создании клеточных систем с
новыми свойствами на основе клеточных взаимодействий. В настоящее время
совершенствуются методы иммунизации вне организма и изучаются механизмы
активации В-лимфоцитов. Это особенно важно для получения моноклональных
антител человека.
Одним из условий дальнейших успехов на пути получения клеток и клеточных
систем с новыми свойствами является углубление знаний, касающихся
фундаментальных основ биологии: механизмов регуляции процесса клеточной
дифференциации, физиологии протопластов как объекта биологической
трансформации клеток, взаимоотношений клеточных органелл. Следовательно,
прогресс в развитии клеточной инженерии будет в значительной степени
определяться успехами в области клеточной биологии и клеточной физиологии.





Реферат на тему: Поползень (птицы нашего края)

-…Когда солнце немного отогреет еще не проснувшийся лес, начинает заливать
свою песню поползень…
- Ой, а кто это такой? - спросила я у мамы, перебив ее рассказ.
- Поползень – это маленькое живое существо, которое относится к классу
птиц. У него очень сильные ноги и красивый заостренный клюв, кстати тоже
очень-очень сильный, потому что именно он служит ему главным добытчиком
пищи: бегая по стволу, птица то и дело засовывает его в щелочки,
трещинки, отверстия, вытаскивая оттуда насекомых и личинок. Иногда
отрывает кусочки коры, иногда даже долбит ствол, как дятел, почувствовав,
что в древесине личинка. Пойманных насекомых поползень расклевывает,
прижав своей изящной лапкой, а крупные семена вставляет в трещины коры и
разбивает ударом его мощного клюва.
А вообще, поползень – великолепное создание. Оранжево- коричневая
окраска грудки и серые, бледные крылышки не позволяют хищнику узнать
среди леса свою, возможно, будущую добычу. Также в птице есть и особая
отличительная черта – темная, почти черная полоска, начинающаяся от крыла
и проходящая через глаза и клюв. Она играет роль маски, и в ней птица
напоминает мушкетера. Будто она встала на защиту кого-то, а клюв – это и
есть ее шпага. И глаза у поползня все время бегают, светятся…
- А птенчики? Сколько маленьких пушистых комочков выводит одна птица?
- Обычно их кладка составляет 7-8 белых яиц с коричнево – красными
пятнышками. Насиживает кладку только самка на это уходит около 13-16 дней
, а затем птенцы находятся еще около трех недель в гнезде, где о них
заботятся их родители. Сначала их кормят пауками, а затем, когда птенцы
становятся более самостоятельными, они сами вводят в свой рацион семена
ели, сосны, лещины.
Перед пополнением поползни устраивают гнезда, обычно в дуплах.
Вход отштукатуривают глиной, смоченной в воде или в собственной слюне.
Эти птицы чаще живут стайками, нежели поодиночке. Но встречаются и
единоличники. А хочешь, я расскажу тебе один случай, как я встретила это
замечательное создание?
Услышав эту фразу, мои глаза загорелись, я улыбнулась, не успев
еще даже мотнуть головой в знак согласия, мама меня уже поняла.
- Лето было в самом разгаре. По традиции, в это время я уже
давно пребывала в лагере .Запах хвои, шум реки Мокши, доносившийся
вместе с ветром до лагеря, Всё это наводила на меня какую-то особую лень,
хотелось просто сесть на тот мягкий ковёр из осыпавшихся иголок сосен,
вздохнуть чистейший воздух и… пофантазировать. Такое со мной случалось
часто .Однажды , когда солнце уже достигло наивысший точки, я решила
отдохнуть. Опрокинув голову, я заметила, как маленький пушистый комочек
что-то делает, сидя на ветке одной из сосен. Приподнявшись, заметила, что
птица жадно занимается добычей корма. Она была настолько красива, что
хотелось взять ее в руки и прижать к себе. Тогда мне было только девять,
и, поэтому, не задумываясь о последствиях, я приблизилась к ней. Но резко,
и даже как-то с насмешкой, она вспорхнула своими тоненькими изящными
крыльями и исчезла среди высоких сосен. Обидно, но впредь я ее не
встречала, хотя, возможно, просто не замечала. Это был самый ответственный
момент, момент доверия в общении с природой.

Тут мама на несколько секунд прекратила свою историю, а затем
добавила: «Спокойной ночи, солнышко!»




Новинки рефератов ::

Реферат: Партизанское движение в СССР в годы ВОВ (История)


Реферат: Управление качеством (шпаргалка) (Менеджмент)


Реферат: Доказательство гражданского права (Гражданское право и процесс)


Реферат: Война 1812 года : причины, ход, последствия (История)


Реферат: Особенности операционной системы UNIX (Информатика)


Реферат: Социальные группы (Социология)


Реферат: Здоровье человека и окружающая среда (Безопасность жизнедеятельности)


Реферат: Иудаизм как религия (Религия)


Реферат: Откуда есть пошла земля русская (История)


Реферат: Нитрование ароматических углеводородов. Производство нитробензола (Технология)


Реферат: Технология выращивания и хранения лука (Сельское хозяйство)


Реферат: Аграрные кризисы (История)


Реферат: Борьба концепций в процессе становления и развития науки о свете (Естествознание)


Реферат: Шпоры к экзамену по Военной подготовке (Военная кафедра)


Реферат: Анализ школьной программы по лыжной подготовке (Спорт)


Реферат: История России (шпаргалка) (Государство и право)


Реферат: Процессы глобализации в экономике (Социология)


Реферат: Шифраторы, дешифраторы, триггеры (Компьютеры)


Реферат: Трехмерная анимация в 3D Studio MAX (Программирование)


Реферат: Взгляды Аристотеля (Философия)



Copyright © GeoRUS, Геологические сайты альтруист